李桂榮　連艷會　程珊珊　全冉　扈惠靈

摘要：對山葡萄、貝達、北醇、無核白、奧迪亞無核、京可晶這6個葡萄品種的1年生休眠枝條進行不同低溫脅迫，測定枝條的相對電導率、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性及可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛、游離脯氨酸含量，并用恢復生長法測定枝條扦插生根率，分析其理化指標變化趨勢，應用Logistic方程建立回歸曲線模型，擬合其半至死溫度（LT50）。結果表明，隨脅迫溫度的降低，各葡萄枝條SOD、POD活性及游離脯氨酸含量整體呈先升后降趨勢，CAT活性呈先升后降再升趨勢，相對電導率及可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛含量整體呈上升趨勢，扦插枝條生根率呈下降趨勢;供試材料的抗寒性強弱依次為山葡萄>貝達>北醇>無核白>奧迪亞無核>京可晶。

關鍵詞：低溫脅迫;抗寒性;生理指標;山葡萄;貝達;可溶性糖;可溶性蛋白;丙二醛;脯氨酸

中圖分類號： S663.101文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0130-05

葡萄（Vitis vinifera L.）果實的含糖量相對較高，達到10%～30%，且含多種微量元素，有增進人體健康、治療神經衰弱和過度疲勞的功效，深受消費者喜愛。目前，我國葡萄栽培多集中在北方地區(qū)，但由于北方冬季寒冷，往往導致葡萄凍害頻頻發(fā)生，給許多果農造成巨大的經濟損失。因此，有關葡萄的抗寒性成為研究熱點，有學者通過測定葡萄相對電導率、防御性酶活性、可溶性糖含量等生理指標來較為系統(tǒng)地研究葡萄抗寒性[1-4]。本試驗以無核白、奧迪亞、京可晶這3個無核葡萄品種1年生休眠期枝條為試材，以中國野生山葡萄、砧木品種貝達及山葡萄雜交種北醇為對照，測定低溫脅迫下葡萄枝條的電解質滲出率、超氧化物酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量等生理指標及脅迫處理后枝條的扦插生根率，分析其抗寒性強弱，為北方地區(qū)葡萄引種、抗寒栽培、種質篩選及抗寒新品種培育提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

2016年11月15—30日，從中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所葡萄種質資源圃內剪取山葡萄、貝達、北醇、無核白、奧迪亞、京可晶這6個葡萄品種的中上部1年生休眠枝條，粗 0.5～1.0 cm、長25～50 cm，長勢較好，健壯，無病蟲害;做好標記，帶回沙藏。試驗前，將材料取出，清洗數次，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2試驗設計

試驗在河南科技學院園藝園林學院園藝植物遺育種實驗室進行，將枝條分別用自來水、去離子水各沖洗3次，濾紙吸干水分;將枝條每個品種平均分成7份，用保鮮膜包好，并用吊牌標記，分別置于4、-5、-10、-15、-20、-25、-30 ℃這7個溫度環(huán)境下進行脅迫處理，以4 ℃/h的速度降到處理溫度，并保持24 h，再以4 ℃/h的速度解凍，每0.5 h回升1個溫度梯度;置于4 ℃冰箱中保存，備用，測定其相關指標。重復3次。

1.3測定指標及方法

采用電導率儀測定相對電導率，分別采用氮藍四唑（NBT）光還原法、愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法測定SOD、POD、CAT活性，分別采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍法、茚三酮比色法、硫代巴比妥酸法測定可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛含量[5]。采用曹建東等的方法[6]測定枝條生根率。

1.4數據分析

采用Excel 2010、DPS 15軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析，采用Origin 8.0軟件擬合Logistic方程，并求得半致死溫度（LT50）。

2結果與分析

2.1不同低溫脅迫對葡萄枝條相對電導率的影響

由圖1可見，不同低溫脅迫處理對不同葡萄品種的枝條相對電導率有明顯影響;隨脅迫溫度的降低，不同葡萄品種枝條的相對電導率總體呈增加趨勢，山葡萄、貝達、北醇枝條的相對電導率變化較為平緩，無核白、奧迪亞、京可晶枝條的相對電導率變化波動較大;奧迪亞、京可晶、無核白葡萄枝條分別在脅迫溫度為 -25～-30 ℃、-20～-30 ℃、-20～25 ℃時相對電導率上升較為明顯，分別由-25 ℃時的51.4%上升到-30 ℃時的 79.7%、-20 ℃時的55.3%上升到-30 ℃時的76.1%、-20 ℃ 時的50.7%上升到25 ℃時的65.7%;無核白、奧迪亞、京可晶這3個無核葡萄品種的枝條相對電導率在-15 ℃前上升緩慢，隨脅迫溫度繼續(xù)降低，枝條相對電導率開始出現躍升，說明這一溫度可能已經對細胞膜造成嚴重傷害，而山葡萄、貝達在溫度降到-30 ℃時才有明顯上升趨勢，說明-15 ℃沒有對其造成傷害。因此，山葡萄、貝達的抗寒性相對較強，而無核白、奧迪亞、京可晶這3個無核葡萄品種的抗寒性相對較弱。

2.2低溫脅迫對葡萄枝條半致死溫度的影響

對不同溫度脅迫下葡萄枝條的相對電導率與相應脅迫溫度進行擬合，獲得Logistic方程[7-10]，并求得半致死溫度。半致死溫度越高，表明抗寒性越弱，反之，半致死溫度越低，表明抗寒性越強。由表1可見，山葡萄、貝達、北醇、奧迪亞、無核白、京可晶的半致死溫度（LT50）分別為-37.83、-36.01、-31.88、-14.51、-15.88、-11.44 ℃，表明抗寒性強弱依次為山葡萄>貝達>北醇>無核白>奧迪亞>京可晶。

2.3低溫脅迫對不同葡萄枝條酶活性的影響

2.3.1SOD活性由表2可見，隨脅迫溫度的降低，不同葡萄枝條的SOD活性呈先升后降趨勢;山葡萄、貝達、北醇、無核白、京可晶、奧迪亞這6個葡萄枝條的SOD活性在-25 ℃時相對最大，分別為310.05、270.32、264.19、260.74、178.70、208.18 U/g，均極顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.01），其中，山葡萄的SOD活性在6個葡萄品種中相對最大，貝達次之;[JP3]隨脅迫溫度的降低，達到-30 ℃時，各葡萄品種枝條SOD活性出現下降，這說明-30 ℃會使葡萄枝條SOD活性可能喪失。

2.3.2POD活性由表2可見，隨脅迫溫度的降低，不同葡萄枝條的POD活性呈先升后降趨勢;山葡萄、貝達、北醇、無核白、京可晶、奧迪亞這6個葡萄枝條的POD活性在-20 ℃時相對最大，分別為16.13、14.56、13.79、13.47、11.52、13.05 U/（g·min），均極顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.01），其中，山葡萄的POD活性在6個葡萄品種中相對最大，貝達次之;當溫度進一步降低，低于-25 ℃時，葡萄枝條POD活性出現持續(xù)下降，這說明低于-25 ℃可能會使葡萄枝條POD活性逐漸喪失。

2.3.3CAT活性由表2可見，隨脅迫溫度的降低，不同葡萄枝條的CAT活性呈先升后降再升趨勢;山葡萄、貝達、北醇、無核白、京可晶、奧迪亞這6個葡萄枝條的CAT活性在-20 ℃時相對最大，分別為55.32、47.35、44.39、42.61、32.18、38.74 U/（g·min），均極顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.01），其中，山葡萄的CAT活性在6個葡萄品種中相對最大，貝達次之。

2.4低溫脅迫對葡萄枝條生理指標的影響

2.4.1丙二醛含量在逆境脅迫下，植物器官往往發(fā)生膜脂過氧化作用而產生丙二醛，丙二醛對生物膜具有一定的損害作用，其含量越高，對生物膜的傷害程度越大，植物抗逆境脅迫能力相對越弱，反之越強[11]。由表3可見，隨脅迫低溫的降低，6個葡萄品種枝條的丙二醛含量呈上升趨勢;-15 ℃前，隨脅迫溫度的降低，丙二醛含量上升相對較為緩慢;溫度達到-20 ℃時，奧迪亞、京可晶枝條的丙二醛含量出現大幅上升，分別比-15 ℃時增加75.9%、65.8%，山葡萄、貝達上升幅度較小，比-15 ℃時分別增加57.9%、59.1%;-30 ℃低溫脅迫時，山葡萄、貝達、北醇、無核白、京可晶、奧迪亞這6個葡萄枝條的丙二醛含量相對最大，分別為0.38、0.39、0.42、0.59、0.68、0.79 μmol/g，多顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.05），根據丙二醛含量高低可判斷各品種枝條耐低溫脅迫高低順序為山葡萄>貝達>北醇>無核白>奧迪亞>京可晶。

2.4.2可溶性糖含量在低溫脅迫下，葡萄枝條會對脅迫做出反應，產生大量的糖以提高細胞的滲透濃度、增加原生質濃度，從而降低冰點，進一步提高枝條的抗逆能力。由表3可見，隨脅迫低溫的降低，6個葡萄品種枝條的可溶性糖含量呈上升趨勢;脅迫溫度由4 ℃到-15 ℃，各葡萄品種枝條可溶性糖含量緩慢上升，脅迫溫度達到-20 ℃時，隨脅迫溫度的降低，各葡萄品種枝條可溶性糖含量先上升較為迅速;-30 ℃ 低溫脅迫時，山葡萄、貝達、北醇、無核白、京可晶、奧迪亞這6個葡萄枝條的可溶性糖含量相對最大，分別為7.32%、6.96%、6.68%、5.44%、5.26%、5.33%，極顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.01）;根據可溶性糖含量高低，可判斷各品種枝條耐低溫脅迫高低順序為山葡萄>貝達>北醇>無核 白> 京可晶>奧迪亞。

2.4.3可溶性蛋白含量可溶性蛋白有較強的親水性，可以使植物細胞的持水力增強，減輕植物體內因原生質結冰而造成的傷害，其含量越高，說明低溫脅迫對植物體造成傷害的機率越小，反之越大。由表3可見，隨脅迫低溫的降低，6個葡萄品種枝條的可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢;脅迫溫度由4 ℃到-25 ℃時，山葡萄、貝達枝條可溶性蛋白含量先上升緩慢，后隨脅迫溫度降低，可溶性蛋白含量上升較為迅速;脅迫溫度由4 ℃到-15 ℃時，奧迪亞、京早晶枝條可溶性蛋白含量先上升緩慢，后隨脅迫溫度降低，可溶性蛋白含量上升較為迅速;-30 ℃低溫脅迫時，山葡萄、貝達、北醇、無核白、京可晶、奧迪亞這6個葡萄枝條的可溶性蛋白含量分別為0.84、0.81、0.72、0.49、0.45、0.46 mg/g，多顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.05）;綜合低溫脅迫后各葡萄品種枝條可溶[CM（25]性蛋白含量高低，得出各品種枝條耐低溫脅迫高低順序為山葡萄> 貝達>北醇>無核白>奧迪亞>京可晶。

2.4.4游離脯氨酸含量在低溫脅迫下，游離脯氨酸含量的增加能維持植物體細胞內環(huán)境的穩(wěn)定，使細胞膜保持結構完整。由表3可見，隨脅迫低溫的降低，6個葡萄品種枝條的游離脯氨酸含量整體呈先升后降趨勢;脅迫溫度由4 ℃到 -25 ℃ 時，山葡萄、貝達枝條游離脯氨酸含量先緩慢上升，后隨脅迫溫度降低，游離脯氨酸含量上升較為迅速;-25 ℃低溫脅迫時，山葡萄、貝達葡萄枝條的游離脯氨酸含量相對最大，分別為63.28、59.28 μg/g，-20 ℃低溫脅迫時，北醇葡萄枝條的游離脯氨酸含量相對最大，為57.87 μg/g，-15 ℃低溫脅迫時，無核白、奧迪亞葡萄枝條的游離脯氨酸含量相對最大，分別為45.83、43.71 μg/g，-10 ℃低溫脅迫時，京可晶葡萄枝條的游離脯氨酸含量相對最大，為40.91 μg/g，均相應極顯著高于其他脅迫溫度處理（P<0.01）;綜合低溫脅迫后各葡萄品種枝條游離脯氨酸含量，得出各品種枝條耐低溫脅迫高低順序為山葡萄>貝達>北醇>無核白>奧迪亞>京可晶。

2.5低溫脅迫對葡萄枝條扦插生根率的影響

由圖2、 圖3可見， 隨脅迫低溫的降低，各葡萄品種枝條

扦插生根率呈下降趨勢;對抗寒性較強的山葡萄、貝達而言，脅迫溫度降到-15 ℃時，其生根率仍然保持在100.0%，溫度降低到-20 ℃時，其生根率稍有降低，溫度降低到-30 ℃時，其生根率分別為45%、38%;對抗寒性較弱的奧迪亞、京可晶而言，脅迫溫度降低到-10 ℃時，其生根率分別為33%、29%，已經低于50%，溫度下降到-15 ℃時，奧迪亞枝條的生根率僅為5%，而京可晶枝條的生根率為0%。

3結論與討論

目前，有研究表明，相對電導率、抗氧化酶活性可以較準確地反映植物的抗寒性[12-14]。本試驗結果表明，隨脅迫溫度的降低，不同葡萄品種枝條的電導率總體呈增加趨勢，抗寒性較強的山葡萄、貝達、北醇枝條其電導率變化較為平緩，而抗寒性較弱的無核白、奧迪亞、京可晶枝條其電導率變化波動較大;山葡萄、貝達、北醇、奧迪亞、無核白、京可晶這6個葡萄品種枝條的半致死溫度分別為-37.83、-36.01、-31.88、-14.51、-15.88、-11.44 ℃，奧迪亞、無核白、京可晶這3個無核品種的半致死溫度均在-10～-20 ℃之間，明顯低于山葡萄、貝達、北醇這3個對照葡萄品種;葡萄枝條酶活性、生理指標與抗寒性有著密切的關系，隨脅迫溫度的降低，不同葡萄枝條的超氧化物酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性呈先升后降趨勢，過氧化氫酶（CAT）活性呈先升后降再升趨勢，這可能是保護酶應對外來脅迫的一種反應，保護酶活性的不斷升高，可防御低溫對枝條造成的傷害，但達到一定溫度時酶活性下降，說明此溫度可能導致枝條受到凍害;隨脅迫溫度的降低，各葡萄品種枝條的丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖含量呈上升趨勢，其相應含量高低可在一定程度上可反映各葡萄品種枝條的抗寒性，這與鐘海霞等的研究結果[15-17]一致;游離脯氨酸含量整體呈先升后降趨勢，這與姜衛(wèi)兵等的研究結論[18-20]基本吻合。因此，相對電導率、SOD活性、POD活性、CAT活性及可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、游離脯氨酸含量變化可作為植物抗寒性的鑒定指標，綜合試驗結果來看，6個葡萄枝條的抗寒性強弱大致為山葡萄>貝達>北醇>無核白>奧迪 亞> 京可晶。

須說明的是，本試驗是在人工模擬的低溫條件下測定，人工低溫處理和室外自然低溫會存在一定差異，在今后研究中應結合自然低溫條件進行抗寒鑒定，從而使植物抗寒性研究更加準確全面。

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