艾力麥爾旦·艾尼瓦爾 張曉莉 卡米力江·買買提明 日孜瓦古力·阿木提 木合塔爾·霍加

牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是外胚間充質(zhì)來源的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]，隨著組織工程技術(shù)的日益發(fā)展，其在各類支架材料和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下成骨向分化相關(guān)的研究愈來愈深入。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)是具有多重效能的生長(zhǎng)因子超家族，參與調(diào)控機(jī)體胚胎發(fā)育、組織再生和免疫系統(tǒng)等眾多方面[2]。TGF-β3 作為TGF-β超家族的一員,在細(xì)胞增殖、分化、信息傳遞、代謝和凋亡的調(diào)節(jié)中起重要作用，是組織工程研究中比較理想的細(xì)胞因子[3]。本課題組前期研究已證實(shí)TGF-β3對(duì)體外培養(yǎng)的兔牙髓干細(xì)胞(rabbit dental pulp stem cells,rDPSCs)增殖無影響但對(duì)其成骨向分化能力有一定促進(jìn)作用，并在20～100 ng/ml范圍內(nèi)呈濃度依賴關(guān)系,以80 ng/ml效果最佳[4]。本實(shí)驗(yàn)探討用80 ng/ml TGF-β3誘導(dǎo)rDPSCs，并將其成骨作用與礦化液(含10%FBS, l%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中加入10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸)和常規(guī)培養(yǎng)的rDPSCs做對(duì)比研究，探討rDPSCs體外在TGF-β3作用下成骨向分化的效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

健康新西蘭幼兔3 只，3～4 周齡，體重1.5～2.0 kg,雌雄不限(由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基 (Hyclone，美國(guó))；TGF-β3(Peprotech,美國(guó))；堿性磷酸酶(ALP)染色液(北京索萊寶)；OCN一抗(Abcam,美國(guó))；COL-I一抗(Novus Biologicals,美國(guó))；Runx-2一抗(北京博奧森)；茜素紅S、L一抗壞血酸(Sigma，美國(guó))；β一甘油酸磷酸鈉、地塞米松(武漢博士德)山羊抗兔二步法檢測(cè)試劑盒(北京中衫金橋)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(RT-qPCR)(Bio-Rad，美國(guó))；倒置顯微鏡(Leica，德國(guó))。

1.2 rDPSCs分離及培養(yǎng)

鹽酸利多卡因快速過量注射兔耳緣靜脈將其處死，無菌條件下取上下頜骨置于預(yù)冷的高倍雙抗中侵泡20 min，移置于培養(yǎng)皿中PBS沖洗3 次，剪除頜骨分離牙齒并剪掉根尖處1 mm牙體組織，拔髓針拔出牙髓，參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[5-6]，酶解組織塊法分離培養(yǎng)原代rDPSCs,每2～3 d換液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿80%～90%后0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代rDPSCs，6×103/L細(xì)胞濃度接種于24 孔板中，分組培養(yǎng)第3、5、7、14 d各取1 塊培養(yǎng)板，4%多聚甲醛固定50 min，PBS洗3 次，5%進(jìn)口羊血清封閉30 min，滴加一抗 (稀釋比例分別為OCN 1∶1 000,COL-I 1∶300，Runx-2 1∶400)4 ℃孵育過夜(至少16 h),PBS洗3 次，滴加二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3 次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，顏色越深表明陽性程度越強(qiáng)。

1.4 RT-qPCR

取第三代細(xì)胞1×106個(gè)/孔接種于6 孔板中分組培養(yǎng)，培養(yǎng)第7、14天，用Trizol法提取細(xì)胞mRNA，第一鏈cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA模板，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。引物由廣州天一輝遠(yuǎn)公司設(shè)計(jì)合成(引物序列見表 1)，PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，40循環(huán)。最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析，Graphpad 7.0軟件繪圖。

表 1 本研究中PCR基因引物序列

1.5 茜素紅染色

取第三代rDPSCs，以2×106/孔濃度接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁隨機(jī)分為3 組開始實(shí)驗(yàn)，第7、14、21天各組取一塊培養(yǎng)板棄培養(yǎng)液，PBS沖洗后用4%多聚甲醛室溫細(xì)胞固定50 min，PBS洗3 次，現(xiàn)配的1%茜素紅染液1 ml室溫孵育30 min后蒸餾水輕輕沖洗表面的染液，自然干燥，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)并拍照，在50 倍鏡下，每個(gè)孔隨機(jī)選取中段5 個(gè)視野計(jì)算其礦化結(jié)節(jié)數(shù)量并分析各組之間的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖 1 原代培養(yǎng)3 d的rDPSCs(倒置顯微鏡， ×50)

Fig 1 Primarly cultured rDPSCs for 3 days (Inverted Microscope, ×50)

2 結(jié) 果

2.1 rDPSCs形態(tài)學(xué)觀察

酶解組織塊法成功分離獲得rDPSCs,48 h即可見組織塊周圍爬出來的原代細(xì)胞(圖 1A)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多呈梭形和紡錘形，少數(shù)呈三角形、多角形。約6～8 d匯合達(dá)到80%～90%，進(jìn)行首次傳代，隨培養(yǎng)時(shí)間和代數(shù)增加細(xì)胞形態(tài)單一呈長(zhǎng)梭形(圖 1B)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組3 d出現(xiàn)COL-I強(qiáng)陽性，Runx-2第7天出現(xiàn)強(qiáng)陽性，OCN第7天出現(xiàn)弱陽性，第14天強(qiáng)陽性；對(duì)照組7 d出現(xiàn)COL-I陽性,第7天Runx-2弱陽性，第14天Runx-2強(qiáng)陽性、OCN弱陽性；空白組第7天出現(xiàn)COL-I弱陽性，14 d Runx-2弱陽性，OCN為陰性(圖 2)。

2.3 RT-qPCR結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果顯示(圖 3)，各組培養(yǎng)第7天在實(shí)驗(yàn)組中ALP、COL-I、Runx-2基因的表達(dá)量均高于空白組(其中ALP、COL-IP<0.01，Runx-2P<0.05)ALP，COL-I基因表達(dá)量高于對(duì)照組(COL-IP<0.01，ALPP<0.05)；培養(yǎng)14 d，實(shí)驗(yàn)組ALP、COL-I、Runx-2、OCN基因表達(dá)均高于空白組(P<0.01)，另外，實(shí)驗(yàn)組ALP、COL-I基因的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖 2 rDPSCs的COL-I免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 (×200)

Fig 2 Immunohistochemical staining for COL-I expression of rDPSCs (×200)

圖 3 rDPSCs中ALP、COL-I、Runx-2、OCN基因表達(dá)情況

2.4 茜素紅染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第7天細(xì)胞排列呈簇狀聚集；培養(yǎng)14 d，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)細(xì)胞匯合并且細(xì)胞排列呈以礦化結(jié)節(jié)為中心的火山口樣、漩渦狀，有的呈長(zhǎng)線形排列，局部聚集成灶，肉眼觀察可見白色結(jié)節(jié)，茜素紅染色即可見多個(gè)大小不等的礦化結(jié)節(jié)，其余兩組均無結(jié)節(jié)。培養(yǎng)21 d,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組均出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)多且明顯(圖 4)。礦化結(jié)節(jié)數(shù)分別為實(shí)驗(yàn)組2.20±0.83,對(duì)照組1.20±0.45，空白組0.40±0.54，實(shí)驗(yàn)組與其余2 組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖 4 rDPSCs茜素紅染色 (×50)

Fig 4 ARS staining of rDPSCs (×50)

3 討 論

創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥以及牙源性、牙周源性疾病引起的頜面部骨缺損的修復(fù)是骨組織工程面臨的重要問題。臨床上常用的頜面部修復(fù)方法主要是自體骨和異體骨移植修復(fù)，其中自體骨移植修復(fù)被公認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但其有自身的缺點(diǎn)如有限的骨組織量，手術(shù)引起的痛苦，免疫問題如炎癥和骨吸收等。所以在最短的時(shí)間內(nèi)盡可能全面地修復(fù)骨缺損仍然是目前骨組織工程的研究熱點(diǎn)。已有研究證實(shí)DPSCs相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)具有更好的克隆形成能力、增殖能力和成骨向分化能力[7-8]，而且DPSCs由顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)發(fā)育而成，與顱頜面骨及牙周組織具有相同的組織來源，因此選取DPSCs作為顱頜面骨缺損修復(fù)較骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有更豐富的分化潛能和同源優(yōu)越性。

目前哺乳類動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)3 個(gè)TGF-β亞型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β3作為較新被發(fā)現(xiàn)的TGF-β亞型，其在軟骨發(fā)生和軟骨再生中的重要調(diào)節(jié)作用相關(guān)研究最為成熟[9]。TGF-β3具有抗纖維化作用，能夠促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和瘢痕形，參與組織修復(fù)的多重過程[10]。Hara等[11]證實(shí)2 μg/ml的醋酸氟輕松(FA)和5 ng/ml 濃度的TGF-β3聯(lián)合人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中缺損部位的軟骨再生。最近有學(xué)者證明了TGF-β3對(duì)干細(xì)胞成骨向分化和成牙本質(zhì)向分化過程中的協(xié)助作用。Deng等[12]發(fā)現(xiàn)25 ng/ml的TGF-β3能夠誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMMSCs)通過激活TGF-β信號(hào)通路向成骨向分化從而刺激骨再生。Huojia等[13]證實(shí)TGF-β3在10～100 ng/μl范圍內(nèi)能夠以劑量依賴的方式促進(jìn)DPSCs的異位礦化、促進(jìn)DPSCs成牙本質(zhì)向分化。但TGF-β3在DPSCs成骨分化和骨形成過程中的作用和機(jī)制尚不清楚。通過本研究，證實(shí)了TGF-β3體外通過上調(diào)成骨標(biāo)志基因的表達(dá)來促進(jìn)rDPSCs的成骨向分化。

鑒定成骨形成的經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)有高表達(dá)ALP，合成COL-I、形成OCN等骨基質(zhì)蛋白、體外形成礦化結(jié)節(jié)。成骨細(xì)胞膜表面表達(dá)高強(qiáng)度的ALP，是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)。COL-I是骨基質(zhì)的重要組成部分，也是成骨細(xì)胞重要的特異性基因。OCN在成骨細(xì)胞分化晚期開始活躍，其表達(dá)升高說明成骨細(xì)胞開始進(jìn)入礦化期[14-15]。Runx-2又稱核心結(jié)合因子Cbfα1，是成骨分化和骨形成過程中的重要調(diào)節(jié)因子，出現(xiàn)在成骨分化的早期，可激活、啟動(dòng)下游包括 ALP、OCN和COL-I等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),在尚未成熟的成骨細(xì)胞中表達(dá)最高而隨著成骨細(xì)胞的成熟其表達(dá)下降[15-16]。本實(shí)驗(yàn)以ALP、COL-I、OCN、Runx-2為檢測(cè)指標(biāo)，RT-qPCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組ALP水平明顯高于其余兩組并第7天表達(dá)量最高，表明實(shí)驗(yàn)組成骨向分化水平一周左右就達(dá)到峰值。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組COL-I，Runx-2，OCN表達(dá)的時(shí)間早且均強(qiáng)于其余兩組。ALP、COL-I、Runx-2及OCN基因含量均高于對(duì)照組，說明TGF-β3誘導(dǎo)rDPSCs通過上調(diào)ALP、COL-I、OCN、Runx-2等的表達(dá)從而加速其成骨向分化，效果優(yōu)于礦化液誘導(dǎo)組。成骨向分化的最終環(huán)節(jié)是細(xì)胞外基質(zhì)礦化，實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)第14天即出現(xiàn)明顯的礦化結(jié)節(jié)，表明TGF-β3誘導(dǎo)組具有比其余兩組更強(qiáng)的體外礦化能力。

綜上，通過本研究證實(shí)80 ng/ml TGF-β3體外能夠促進(jìn)rDPSC向成骨向分化，有效縮短其成骨時(shí)間，為將其運(yùn)用到頜面部及種植體周圍骨缺損的修復(fù)及組織工程提供了一定的依據(jù)和新的視角。