金諾 王璐 張洲銘 同瑾 李德超

軟骨自身修復(fù)能力非常有限，創(chuàng)傷、代謝和炎癥均可引起不可逆的軟骨損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺損，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量。目前，關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床治療方法主要有關(guān)節(jié)鏡技術(shù)，軟骨移植等，但至今仍沒有一種臨床方法可以實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的再生[1]。隨著利用間充質(zhì)干細胞(MSC)治療難治性疾病的研究和臨床應(yīng)用不斷涌現(xiàn)，通過組織工程的方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損成為目前的研究熱點[2]。

脫細胞基質(zhì)支架是通過將生物組織通過脫細胞的方法獲得的低免疫排斥性的組織工程支架。其低免疫原性和良好的生物相容性成為組織工程的又一研究熱點[3]。經(jīng)過脫細胞處理的真皮、心包、角膜、血管、膀胱 食管、小腸黏膜基質(zhì)、骨、肝臟、肌肉、肌腱、腹壁等作為相應(yīng)組織的組織工程支架在動物實驗中均顯示出良好的應(yīng)用前景[4-8]。然而，脫細胞過程中引發(fā)的毒性試劑殘留以及支架理化性能的改變?nèi)韵拗屏嗣摷毎|(zhì)的使用。尤其是關(guān)節(jié)缺損區(qū)往往為力學(xué)承載區(qū)和快速損耗部位，對材料的理化性能要求頗高，因此對組織工程支架的性能有著更苛刻的要求。

此研究優(yōu)化了軟骨脫細胞基質(zhì)的制備方法，在去除同種異體軟骨脫細胞基質(zhì)免疫原性的同時維持了支架的理化性能，并通過兔膝關(guān)節(jié)缺損模型驗證了材料的關(guān)節(jié)缺損修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 細胞原代培養(yǎng)

新西蘭大白兔(新生2 周)(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實驗動物中心)肌肉注射過量戊巴比妥鈉(吉林華牧)猝死后取材。取兔耳浸泡于75%酒精中30 min，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)浸洗3 遍。去除耳部皮膚及耳軟骨骨膜，徹底游離兔耳軟骨。將兔耳軟骨剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片。用含青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/ml)的PBS反復(fù)沖洗3 次。軟骨樣品加入含有0.2%膠原酶II型(Gibco，美國)含10%胎牛血清(Hyclone，美國)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，在搖床,37 ℃，120 r/mim，孵育12 h。消化完成后的軟骨細胞懸液使用200 目的濾網(wǎng)過濾后，1 000 r/min離心5 min；棄上清，重懸細胞。軟骨細胞培養(yǎng)液：15%胎牛血清，L-谷氨酰胺(272 mg/ ml；Sigma,美國)，抗壞血酸2-磷酸酯(50 mg/ml；Sigma,美國)，10 ng/ml堿性磷酸酶10 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF,intitrogen，美國)的DMEM-低糖培養(yǎng)基。孵箱內(nèi)原代培養(yǎng)48 h后初次換液，其后隔天換液。顯微鏡(Leica，德國)下觀察細胞生長情況，細胞融合率達80%～90%時，用胰酶(0.25%；索萊科技有限公司)消化傳代[9]。

取實驗兔脛骨，剪斷脛骨兩端，用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集含有骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液后離心，加入新的骨髓干細胞培養(yǎng)液：10%胎牛血清(Hyclone，美國)的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，重懸，原代培養(yǎng)48 h后初次換液，其后隔天換液。待細胞貼壁生長到培養(yǎng)瓶底部面積的80%～90%時傳代。

1.2 軟骨脫細胞膜片的制備

取二代軟骨細胞，以1×107/cm2的密度接種在10 cm細胞培養(yǎng)皿中，加入軟骨細胞培養(yǎng)液，隔天換液。高密度培養(yǎng)3 周后，取出軟骨細胞膜片。數(shù)碼相機拍照后進行常規(guī)HE染色和DAPI染色，在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察并拍照。用細胞刮刀輕輕刮起細胞膜片，并用PBS漂洗3 次，5 min/次；然后加入10 ml的1%SDS脫細胞液，置于37 ℃，120 r/min恒溫搖床內(nèi)孵育，在30 min,1 h 和4 h時換SDS，孵育24 h后，棄去脫細胞液，PBS漂洗3 次，5 min/次；加入適量的1% Triton-X100，30 min后倒掉脫細胞液，再加入適量的PBS搖床上120 r/min漂洗24 h，之后加入5 ml，0.5 mg/ml脫氧核糖核酸酶。PBS 漂洗脫細胞膜片3 次，15 min/次，在用PBS浸泡24 h[10]。

1.3 掃描電鏡

軟骨脫細胞基質(zhì)放入6 孔板內(nèi)，無菌鋼環(huán)壓住膜片，加入BMSC細胞懸液，將MSC細胞與脫細胞基質(zhì)共同培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中(MSC+)，植入細胞第10天，將孔板中的培養(yǎng)基吸掉，固定、脫水、-80 ℃冷凍，冷凍干燥24 h。凍干后的單純軟骨脫細胞基質(zhì)和負載細胞后的軟骨脫細胞基質(zhì)噴金后SEM觀察表面形態(tài)。

1.4 軟骨向分化相關(guān)基因的檢測

脫細胞膜片CO60放射48 h消毒，待用。實驗分3 組，在普通培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的BMMSCs(BMMSCs組);軟骨脫細胞基質(zhì)放入6 孔板內(nèi)，無菌鋼環(huán)壓住膜片，加入BMMSCs細胞懸液，與軟骨脫細胞基質(zhì)共培養(yǎng)但未接觸的BMMSCs(BMMSCs-組)；軟骨脫細胞基質(zhì)表面接觸生長的BMMSCs(BMMSCs+ 組)。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育將3 組分別培養(yǎng)至3、 5、7和21 d后將各組BMMSCs用E.Z.N.A.Total Kit I提取試劑盒(OMEGA, 美國)提取樣本總 RNA，酶標儀測總 RNA 濃度， PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA 后。取樣本 cDNA 進行使用 PrimeScript RT Master Mix(Perpect Real Time)試劑盒(TakaRa，日本)反應(yīng)體系行Real-time PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40 次(表 1)。

表 1 實時定量PCR引物序列

1.5 動物分組及模型構(gòu)建

將新西蘭大白兔按0.05 ml/kg肌肉注射里陸眠寧誘導(dǎo)麻醉，10 min后耳緣靜脈按0.1 ml/kg注射1%戊巴比妥注射液進行全身麻醉。碘伏消毒后鋪單，推開髕骨韌帶后于右腿膝關(guān)節(jié)外側(cè)做矢狀切口，分層剝離暴露膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面。用直徑為4 mm的環(huán)鋸在股骨膝關(guān)節(jié)面制造制造直徑為4 mm，深度為4 mm的骨和軟骨全層缺損，期間用生理鹽水進行沖洗降溫。對照組：關(guān)節(jié)缺損空白對照；實驗組：將凍干滅菌的軟骨脫細胞基質(zhì)膜片植入關(guān)節(jié)缺損部位。復(fù)位髕骨韌帶，分層縫合傷口進行縫合。術(shù)后連續(xù)按0.5 ml/kg肌肉注射0.5 g/ml先鋒3 d。術(shù)后12 周取材，觀察軟骨缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.6 HE及免疫組化染色

用4%多聚甲醛固定軟骨細胞膜片和軟骨脫細胞基質(zhì)，石蠟包埋切片后行HE染色(脫蠟至水后，將切片放入蘇木精染液中15 min，自來水洗5 min，用1%鹽酸酒精分化20 s，自來水漂洗2 min；弱堿性水返藍45 s；自來水漂洗10 min后開始伊紅染色，細胞質(zhì)染10 min；脫水透明后，用中性樹膠封片)和DAPI熒光染色并在-80 ℃冰箱過夜后凍干機凍干24 h。

處死動物取出膝關(guān)節(jié)樣本后，4%多聚甲醛固定48 h后浸泡在10%EDTA(雷根生物有限公司)脫鈣液脫鈣3 個月，脫鈣完成后石蠟包埋，切片(厚度：5 μm)。HE染色并用兔HITC試劑盒(中杉金橋)進行COL-II染色，步驟參考說明書。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 軟骨脫細胞基質(zhì)的制備

肉眼觀察軟骨細胞膜片呈毛玻璃狀(圖 1A)，經(jīng)脫細胞處理后呈透明膠凍樣物質(zhì)(圖 1D)。HE染色可見軟骨細胞膜片中的復(fù)層細胞結(jié)構(gòu)以及大量細胞外基質(zhì)(圖 1B)，而軟骨脫細胞基質(zhì)的HE 染色顯示軟骨細胞全部去除，軟骨陷窩結(jié)構(gòu)清晰，細胞外基質(zhì)成分完整，形成一個多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖 1E)。DAPI染色也可見軟骨細胞膜片中的大量細胞核染色(圖 1C)，而脫細胞膜片內(nèi)無細胞核染色(圖 1F)。說明本方法可良好去除組織內(nèi)的細胞成分(抗原成分)，并完整保存細胞外基質(zhì)的構(gòu)架和理化性能。

2.2 軟骨脫細胞基質(zhì)可誘導(dǎo)BMMSCs軟骨向分化并分泌細胞外基質(zhì)

通過實時定量PCR檢測：I型膠原 (COL-I)、II 型膠原 (COL-II)、X型膠原(COL-X)、軟骨蛋白聚糖(Aggrecan)、 SOX-9在BMMSCs、BMMSCs-和BMMSCs+組的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)： BMMSCs+組中COL-I的表達量顯著低于BMMSCs、BMMSCs-組(P<0.01)，而BMMSCs-組中COL-I的表達量又明顯低于BMMSCs組。說明軟骨脫細胞基質(zhì)可通過接觸或非接觸的方式抑制BMMSCs的成骨向分化。接觸時間的延長對其成骨抑制作用并無明顯作用。

BMMSCs+組中COL-II的表達量顯著高于BMMSCs、BMMSCs-組(P<0.01)，而BMMSCs-組中COL-II的表達量又明顯低于BMMSCs組。說明軟骨脫細胞基質(zhì)可通過接觸或是非接觸的方式促進BMMSCs的軟骨向分化。且軟骨脫細胞基質(zhì)對BMMSCs可起持續(xù)的軟骨向誘導(dǎo)作用。在接觸前期，接觸時間越長，其誘導(dǎo)作用越強。

BMMSCs+組中COL-X的表達量顯著低于BMMSCs、BMMSCs-組(P<0.05)，而BMMSCs-組中COL-X的表達量又顯著低于BMMSCs組。說明軟骨脫細胞基質(zhì)可通過接觸或是非接觸的方式抑制BMMSCs的軟骨肥大和骨向分化。Aggrecan是軟骨的主要結(jié)構(gòu)大分子，3 組間并未見顯著差異，說明軟骨脫細胞基質(zhì)對Aggrecan的合成并無顯著促進作用。COL-II、Aggrecan基因表達升高的同時SOX-9也隨之增高且表達量顯著高于BMMSCs-、BMMSCs組。軟骨脫細胞基質(zhì)軟骨脫細胞基質(zhì)可能是通過SOX-9通路通過接觸或是非接觸的方式促進BMMSCs的軟骨向分化(表 2)。

表 2 軟骨向分化相關(guān)基因的表達

掃描電鏡觀察可見軟骨脫細胞基質(zhì)表面粗糙度良好，顯示出良好的親水性，并可見部分細胞陷窩(圖 2A)。將BMMSCs種植與DCM表面7 d后的可見細胞黏附于DCM支架表面，并長入軟骨陷窩內(nèi)。DCM上大量細胞生長狀態(tài)良好，可見偽足伸出，并可見大量細胞外基質(zhì)分泌(圖 2B)。以上結(jié)果顯示軟骨脫細胞基質(zhì)支架生物相容性良好，無明顯細胞毒性，與DCM接觸可促進BMMSCs分泌細胞外基質(zhì)。

2.3 軟骨脫細胞基質(zhì)促進兔關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)

術(shù)后12 周取材對照組在軟骨缺損區(qū)仍可見明顯的中央凹陷區(qū)及缺損界限(圖 3A)。HE染色也可見對照組缺損區(qū)新生軟骨與周圍正常軟骨質(zhì)間有明顯界限(圖 3B)，軟骨下骨質(zhì)骨化不全。免疫組織化學(xué)染色顯示缺損區(qū)表面Ⅱ型膠原表達量尚可但不均一(圖 3C)。

與對照組相比，實驗組軟骨缺損基本修復(fù)，表面覆蓋軟骨較完整，缺損區(qū)軟骨與周圍軟骨邊界移行良好(圖 3D)。HE染色見實驗組缺損區(qū)新生軟骨與周圍正常軟骨質(zhì)地相似并融合良好，且軟骨下骨質(zhì)恢復(fù)良好(圖 3E)。實驗組軟骨缺損區(qū)表面Ⅱ型膠原表達豐富且均勻，與周圍正常軟骨的表達量基本一致(圖 3F)。

圖 2 DCM用于兔膝關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)

圖 3 DCM可良好修復(fù)兔關(guān)節(jié)缺損

3 討 論

成熟的軟骨沒有血管、神經(jīng)組織和淋巴管，因此，如有損傷，其自我修復(fù)能力非常有限，損傷往往最終導(dǎo)致嚴重的軟骨病變，如關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)退變等[1]。目前骨缺損的治療方式包括自體或異體軟骨移植。但是自體骨移植存在很多問題如：來源有限、供區(qū)損傷和增加患者痛苦等缺點。而異體軟骨移植也有與宿主存在排斥反應(yīng)和來源受限等問題。不過隨著組織工程學(xué)的興起和發(fā)展，關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)將成為可能[11]。

軟骨組織工程是通過植入結(jié)構(gòu)和功能上類似軟骨的支架，促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生。細胞外基質(zhì)(ECM)即組織中除細胞以外的所有成分，其中的膠原，非膠原糖蛋白 彈性蛋白 糖胺多糖等都具有重要的生物學(xué)性能，對細胞形狀，細胞的遷移、增值、分化和代謝等有著直接的影響，其本身即是一種良好的組織工程支架材料。實驗表明組織脫細胞基質(zhì)可以為干細胞提供良好的生長環(huán)境，并在誘導(dǎo)干細胞的定向分化，最終達到組織再生的目的[10,12]。但是脫細胞不全以及脫細胞試劑的殘留是導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)和材料毒性是修復(fù)失敗的原因。本研究用過體外擴增軟骨細胞數(shù)量，促進軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)，并通過脫細胞等方法去除同種異體移植物的免疫原性來制造組織工程軟骨支架。研究發(fā)現(xiàn)，通過體外培養(yǎng)的軟骨膜片脫細胞徹底，免疫原性和細胞毒性極低，并且可以良好保持軟骨細胞外基質(zhì)的理化性能和軟骨誘導(dǎo)活性。BMMSCs是骨髓來源的具有多向分化潛能的干細胞,可分化為成骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞等多種細胞。關(guān)節(jié)損傷后，關(guān)節(jié)下方的骨髓腔則會就近提供BMMSCs參與組織修復(fù)[13-14]。因此該研究選擇將BMMSCs與軟骨脫細胞基質(zhì)共同培養(yǎng)來模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況，從而客觀反映材料的生物相容性及對BMMSCs分化的影響[15]。SEM觀察到BMMSCs在軟骨脫細胞基質(zhì)表面粘附良好，不但維持了BMMSCs的增殖能力還促進了BMMSCs分泌細胞外基質(zhì)。qPCR發(fā)現(xiàn)BMMSCs與軟骨脫細胞基質(zhì)接觸時COL-II表達量顯著高于BMMSCs-、BMMSCs組，并且在前期隨著時間增加，誘導(dǎo)能力還有所增強。COL-II是軟骨的重要組成部分，是BMMSCs軟骨向分化的標志蛋白。SOX-9是BMMSCs軟骨向分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]，研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs與軟骨脫細胞基質(zhì)接觸時SOX-9的表達在BMMSCs+組同樣較高，并且在前期隨著時間增加，表達量持續(xù)提高，因此軟骨脫細胞基質(zhì)可能是通過SOX-9通路誘導(dǎo)了BMMSCs的軟骨向分化。COL-I和COL-X為BMMSCs的骨向分化以及軟骨肥大的標志蛋白，二者表達在BMMSCs+中明顯降低且較BMMSCs-、BMMSCs組低，表明軟骨脫細胞基質(zhì)抑制了BMMSCs的軟骨肥大和骨向分化。通過SEM也觀察到軟骨脫細胞基質(zhì)可促進BMMSCs的外基質(zhì)合成和分泌。

之后觀察了同種異體軟骨脫細胞基質(zhì)在修復(fù)新西蘭大白兔關(guān)節(jié)缺損中的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的關(guān)節(jié)表面較對照組更加平整，與周邊正常軟骨結(jié)構(gòu)融合更好。說明軟骨脫細胞基質(zhì)不但可以促進關(guān)節(jié)缺損區(qū)的軟骨修復(fù)，還可以快速誘導(dǎo)軟骨下骨支持結(jié)構(gòu)的形成。推測脫細胞基質(zhì)膜片是通過在缺損區(qū)快速形成軟骨后，通過軟骨內(nèi)骨化來促進軟骨下骨支持結(jié)構(gòu)形成的。此種修復(fù)方式也符合正常關(guān)節(jié)生長發(fā)育的生理模式。關(guān)節(jié)脫鈣后通過HE染色和COL-II的免疫組織化學(xué)染色觀察了軟骨缺損區(qū)結(jié)構(gòu)微觀修復(fù)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組新生軟骨與正常軟骨結(jié)構(gòu)相似并與周圍軟骨較多融合，軟骨下骨組織恢復(fù)更好，COL-II表達量更高，表達量接近周圍正常軟骨。

綜上所述，軟骨脫細胞基質(zhì)是一種可以誘導(dǎo)BMMSCs軟骨向分化的優(yōu)良組織工程支架。通過改進，大大降低了同種異體軟骨脫細胞基質(zhì)的免疫原性和細胞毒性，在體內(nèi)關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)中取得了滿意的治療效果，為同種異體軟骨脫細胞基質(zhì)在關(guān)節(jié)缺損的臨床應(yīng)用提供了良好的理論支持。