□ 劉新梅 程逸宇 吳海晶 任 敏 馮秋實(shí) 楊 軍 南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種常見的兼性需氧革蘭氏陽性致病菌，極易污染乳制品、米飯、水果制品等食品[1]。目前，檢測方法主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，耗時費(fèi)力，難以適應(yīng)現(xiàn)代食品生產(chǎn)的檢驗需要。

蠟樣芽孢桿菌實(shí)時熒光PCR技術(shù)因具有檢測時間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛運(yùn)用。蠟樣芽孢桿菌在食品中多以芽孢形態(tài)存在，常規(guī)DNA提取方法很難從蠟樣芽孢桿菌芽孢中提取高質(zhì)量DNA，對PCR檢測的靈敏度造成一定的影響。為提高蠟樣芽孢桿菌芽孢DNA提取率，增加實(shí)時熒光PCR檢測靈敏度，本文采用液氮研磨法等方法進(jìn)行試驗，找出適合的提取方法。

qPCR法檢測蠟樣芽孢桿菌還有一定的局限性，即不能區(qū)分檢測到的DNA來自于死細(xì)胞還是活細(xì)胞，這造成qPCR檢測法相對于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法存在假陽性情況。為解決這一問題，相繼開發(fā)出mRNA檢測法、免疫法等活菌檢測方法，但都存在著各方面不足[2]。疊氮溴化乙錠（EMA）是一種DNA 插入型染料，能夠透過細(xì)菌破損的細(xì)胞膜與DNA相交聯(lián)，抑制PCR反應(yīng)的進(jìn)行。EMA與PCR相結(jié)合，可以精確地檢測樣品中活菌的存在[3]。本文將EMA運(yùn)用到蠟樣芽孢桿菌實(shí)時熒光PCR檢測中，提高qPCR檢測的準(zhǔn)確度，降低假陽性率。

1 材料和方法

1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63301。

1.2 儀器設(shè)備

ABI 7500FAST實(shí)時熒光PCR儀、生物安全柜、超聲波細(xì)胞破碎儀、顯微鏡。

1.3 蠟樣芽孢桿菌芽孢的制備

蠟樣芽孢桿菌芽孢形成可以通過營養(yǎng)限量進(jìn)行誘導(dǎo)，在培養(yǎng)基中添加Mn2+能提高芽孢的得率及穩(wěn)定性。孔雀石綠染色鏡檢芽孢生成情況。蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株活化后，接種到營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)三代后，取新鮮培養(yǎng)的菌液接種到含Mn2+營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨5 g,牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，MnSO4· H2O 5 mg，加水至 1 000 mL，pH 值為 7.2），30 ℃分別培養(yǎng)24、36、48、60 h，觀察芽孢生成情況。

1.4 芽孢DNA提取

蠟樣芽孢桿菌接種到Mn2+營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)60 h。挑取單個菌落到1 mL滅菌水中，12 000 r/min離心2 min，棄上清，收集菌體，用于下步DNA提取。

1.4.1 液氮研磨法

在收集菌體的離心管中加入液氮冷卻，使用研磨棒進(jìn)行研磨，重復(fù)上述操作2次，加入500 μL無菌水，渦旋30 s，12 000 r/min 離心 2 min，取上清用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA。

1.4.2 溶菌酶法

向收集菌體的離心管加入500 μL無菌水，渦旋30 s，再加入1 μL溶菌酶（100 mg/mL），37 ℃水浴2 h，12 000 r/min離心2 min，取上清提取DNA。

1.4.3 煮沸法

在菌體中加入 500 μL 無菌水，渦旋30 s，置95 ℃水浴 5 min，12 000 r/min 離心2 min，取上清提取DNA。

1.4.4 超聲波破碎法

向離心管中加入 500 μL 的無菌水，渦旋30 s，放入超聲波細(xì)胞破碎儀超聲波振蕩20 min（40%，5 s，5 s），12 000 r/min 離心 2 min，取上清提取DNA。

1.5 EMA使用濃度優(yōu)化

用 ddH2O 配 制 0.1 mg/mL 的EMA 溶液，-20 ℃避光保存。取Mn2+營養(yǎng)肉湯中30 ℃培養(yǎng)48 h的蠟樣芽孢桿菌菌液于80 ℃水浴中處理20 min，滅活營養(yǎng)體細(xì)胞。將EMA（0.1 mg/mL）分別加入裝有1 mL上述滅活菌液的離心管中，使EMA 終質(zhì)量濃度分別達(dá)到 0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL，不加EMA 的菌液作為對照。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5 min，讓EMA與細(xì)菌DNA充分結(jié)合。然后將離心管放置冰上，強(qiáng)光下曝光 20 min，以此為模板采用超聲波破碎法提取DNA。

1.6 EMA 光照時間優(yōu)化

添加EMA到1.5中所述滅活菌液1 mL離心管中，使每管 EMA終濃度達(dá)到 2.0μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置 5 min。然后將離心管放置冰上，分別強(qiáng)光下曝光 0、1、5、10、20、40 min，不加EMA的菌液作為對照。以此為模板采用超聲波破碎法提取DNA。

圖1 不同DNA提取方法效果比較

圖2 不同濃度EMA處理對EMA-qPCR結(jié)果影響

圖3 不同光照時間處理對EMA-qPCR結(jié)果影響

1.7 熒光定量PCR檢測

利 用Primer Express 3.0軟 件，根據(jù)蠟樣芽孢桿菌pc-plc基因序列，設(shè)計引物和探針（南京金斯瑞生物公司合成）。上游引物：5’-AAAGATTGGTTCGTGAGAGC-3’；下 游 引 物：5’-CGCTTACCTGTC A T T G G T G-3’； 探 針：5’FAM-ACAAGAATATGCAGAT AAATGGCGCGCTG- TAMRA 3’，擴(kuò)增條帶大小163bp。

PCR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物各 0.5 μL，探針 1 μL，模板 DNA5 μL，無菌水補(bǔ)足 25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，40 循環(huán)。

1.8 人工污染實(shí)驗

將蠟樣芽孢桿菌接種到10 mL鮮牛奶中，37 ℃分別培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，80 ℃水浴20 min殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，在熱處理前后分別吸取1 mL樣品涂布到MYP培養(yǎng)基上計數(shù)。將熱處理后的樣品分設(shè)為EMA處理組（10.0 μg/mL EMA黑暗放置5 min，光照10 min）和無EMA處理，再使用超聲波破碎法提取樣品蠟樣芽孢桿菌芽孢DNA，進(jìn)行qPCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢的制備

蠟樣芽孢桿菌含Mn2+離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、36、48、60 h時，芽孢的生成率分別為0%、41.6%、77.3%、90.1%。培養(yǎng)60 h后，90%以上的細(xì)菌形成芽孢，適合下一步實(shí)驗使用。

2.2 DNA提取方法不同對實(shí)時熒光PCR的影響

使用4種不同方法提取的DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果如圖1所示。液氮研磨法和煮沸法提取的DNA經(jīng)qPCR擴(kuò)增，Ct值分別為21.78和29.54。超聲波破碎法提取的DNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，Ct值為18.29，小于其他2種方法。溶菌酶法不能提取芽孢中的DNA。結(jié)果表明，超聲波破碎法得到的DNA質(zhì)量要明顯強(qiáng)于煮沸法和液氮研磨法。

2.3 EMA使用濃度優(yōu)化

實(shí)驗結(jié)果如圖2所示：不加入EMA處理的樣品Ct值最低為18.64，隨著EMA濃度的增加，Ct值也逐漸增加。低濃度 EMA（0.1～1.0 μg/mL）處理對Ct值得影響不大，僅有略微上升。稍高濃度 EMA（2.0～10.0 μg/mL）處理使得Ct值有顯著的上升。10.0 μg/mL以上高濃度EMA處理Ct值就不再升高。EMA濃度過低不能全部去除死菌DNA的干擾，出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果，EMA處理濃度控制在5.0～10.0 μg/mL之間較為適宜。

表1 人工污染實(shí)驗

2.4 EMA 光照時間優(yōu)化

可見光照射使EMA分解從而不能抑制PCR擴(kuò)增。若光照時間不足，則EMA不能被完全鈍化，影響PCR反應(yīng)進(jìn)行，出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果。如圖3所示，EMA處理的樣本在不進(jìn)行光照時Ct值遠(yuǎn)高于對照組，為36.77；隨著光照時間的延長，Ct值逐漸下降，光照10 min時達(dá)到最小值24.11；光照10 min以后再延長光照時間則對PCR結(jié)果沒有任何影響，Ct值穩(wěn)定在24.10左右。實(shí)驗結(jié)果表明，光照時間控制在10 min左右是較好的選擇。

2.5 人工污染實(shí)驗結(jié)果

將蠟樣芽孢桿菌接種到新鮮牛奶中，37 ℃培養(yǎng)72 h，再80 ℃熱處理20 min，測定熱處理前后的菌數(shù)，熱處理前的菌量可以視為牛奶中總的含菌量，加熱滅菌后菌量則為芽孢含量，實(shí)驗結(jié)果見表1。無EMA處理的PCR結(jié)果受到死細(xì)菌DNA的影響，Ct值與活菌量之間沒有明顯的相關(guān)性；經(jīng)EMA處理后PCR結(jié)果不再受到死細(xì)菌的干擾，與細(xì)菌芽孢數(shù)呈明顯的負(fù)相關(guān)性，隨著芽孢數(shù)量的增加而降低。

3 討論

PCR檢測蠟樣芽孢桿菌芽孢中，常規(guī)DNA提取方法難以提取芽孢DNA，導(dǎo)致PCR檢測靈敏度偏低，假陰性率較高。本實(shí)驗比較煮沸法、液氮研磨法、超聲波破碎法、溶菌酶法等4種不同方法提取芽孢DNA效果。其中，超聲波破碎法效果最佳，所得DNA濃度明顯高于其他。EMA處理能有效去除復(fù)雜樣本中死菌DNA，提高蠟樣芽孢桿菌芽孢檢測準(zhǔn)確率。對蠟樣芽孢桿菌樣本進(jìn)行10.0 μg/mL濃度EMA處理及10 min光照，能夠得到較為理想的檢測結(jié)果。通過對牛奶進(jìn)行人工添加蠟樣芽孢桿菌實(shí)驗結(jié)果也支持上述結(jié)論，進(jìn)行EMA處理的PCR結(jié)果與芽孢數(shù)呈明顯的負(fù)相關(guān)性，而未進(jìn)行EMA處理的PCR結(jié)果受到死細(xì)菌DNA的嚴(yán)重干擾，不能準(zhǔn)確地反映細(xì)菌總量，并且容易出現(xiàn)假陽性的情況。