□ 吳新文 貴州省流通環(huán)節(jié)食品安全檢驗中心 馬 凱 貴州省分析測試研究院 張世芹 田 璞 貴州省流通環(huán)節(jié)食品安全檢驗中心

嬰幼兒配方乳粉中的營養(yǎng)成分主要有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素等。維生素是維持人體生命活動必需的一類有機物質(zhì)，也是保持人體健康的重要活性物質(zhì)[1]。維生素A又名視黃醇，維生素A對于嬰幼兒骨骼和視力的生長發(fā)育有很大的作用，維生素A不但可以維持正常的視覺功能，防止夜盲癥，而且具有維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整與健康、促進(jìn)機體正常生長發(fā)育、增強機體的造血功能和預(yù)防癌癥等十分重要的功能[2]。維生素D主要包括維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）[3]。維生素D是人類生長發(fā)育過程中不可缺少的重要物質(zhì)，維生素D缺乏不僅可導(dǎo)致鈣的吸收利用降低，出現(xiàn)佝僂病、骨軟化癥、骨量減少及骨質(zhì)疏松，而且可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂[4]；維生素E，是主要的抗氧化劑之一，可以幫助嬰幼兒對抗外界的氧化壓力，最大限度的利用嬰幼兒自身的抵抗力對抗疾病，對嬰幼兒的成長尤為重要[5]；β-胡蘿卜素，經(jīng)人體攝入，可以轉(zhuǎn)化成維生素A，是目前最安全的補充維生素A的產(chǎn)品，它可以維持眼睛和皮膚的健康，改善夜盲癥、皮膚粗糙的狀況，有助于幫助身體免受自由基的傷害[6]。

目前，測定維生素A、D3、E和β-胡蘿卜素的方法主要有紫外分光光度法、薄層層析法、熒光法、氣相色譜法和高效液相色譜法等[1-13]，由于高效液相色譜法具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高及可同時測定多種維生素等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，用高效液相色譜法測定維生素A、D3、E和β-胡蘿卜素，一般需要對樣品進(jìn)行皂化、萃取、濃縮等步驟，維生素A和E濃縮后可直接通過反相液相色譜測定，但維生素D3濃縮后直接通過反相液相色譜測定，樣品雜質(zhì)干擾較大，定性、定量都不準(zhǔn)確[1-13]。本文通過優(yōu)化樣品的前處理條件和儀器色譜條件[1-12]，采取統(tǒng)一皂化萃取，分兩部分進(jìn)行濃縮，一部分濃縮后直接通過反相液相色譜儀同時測定維生素A和E，另一部分濃縮后先經(jīng)正相液相色譜儀，根據(jù)保留時間收集維生素D3和β-胡蘿卜素餾分，再次濃縮后，通過反向液相色譜儀同時測定維生素D3和β-胡蘿卜素，建立了一種同時測定嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D3、E和β-胡蘿卜素的方法。該方法提高了實驗室的檢測效率，同時降低了檢測成本，為嬰幼兒配方乳粉的安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐 。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀，配置DAD檢測器，自動進(jìn)樣器（配有20μL樣品環(huán)）；Agilent 1100高效液相色譜儀，配置VWD檢測器，手動進(jìn)樣器（配有500μL樣品環(huán)）；氮吹儀等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：維生素A純度≥98%、維生素E（α-生育酚純度≥96%、β-生育酚純度≥98%、γ-生育酚純度≥96%及σ-生育酚純度≥96%）、維生素D3純度≥98%、β-胡蘿卜素純度≥97%。

試劑：氫氧化鉀（分析純）、甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）、石油醚（分析純）、乙醚（分析純）、抗壞血酸（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、正己烷（色譜純）、環(huán)己烷（色譜純）、異丙醇（色譜純）和超純水（自制）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚、維生素D3及β-胡蘿卜素25.0 mg于不同的小燒杯中，加無水乙醇溶解，再用無水乙醇分別轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，配制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃ 避光保存1個月。

1.4 樣品前處理

樣品皂化。取20 g樣品于250 mL皂化瓶中，加入5 g抗壞血酸，100 mL無水乙醇，50 mL濃度為50%的氫氧化鉀溶液，搖勻后，在85 ℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中回流皂化30 min，皂化后立即取出，放入冰水浴中冷卻。

樣品萃取。將皂化液轉(zhuǎn)移入500 mL分液漏斗中，用100 mL水分3次洗滌皂化瓶，洗液并入分液漏斗，加入100 mL石油醚+乙醚（1+1）混合溶液，振搖萃取5 min，靜置分層，下層液體轉(zhuǎn)移到另一個分液漏斗中，加100 mL石油醚+乙醚（1+1）混合溶液重復(fù)萃取一次，棄去下層液體，合并醚層到一個分液漏斗中，用200 mL水洗醚層，輕輕振搖，防止乳化，靜置分層，棄去水層，重復(fù)3次。

脫水定容。將醚層過無水硫酸鈉脫水，用石油醚洗滌并定容至250 mL。

濃縮定容。取100 mL上述定容液，50 ℃氮氣吹干，加入5 mL無水乙醇溶解，過膜，通過反相高效液相色譜儀，測定維生素A和維生素E。另取100 mL上述定容液，50 ℃氮氣吹干，加入2 mL正己烷+環(huán)己烷（1+1）并按體積分?jǐn)?shù)0.8%加入異丙醇的混合溶液溶解備用。

餾分收集。取上述備用液500 μL注入正相高效液相色譜儀中，根據(jù)維生素D3和β-胡蘿卜素的保留時間收集其餾分于同一試管中。

濃縮。將上述餾分，50 ℃氮氣吹干，加入200 μL無水乙醇溶解，反相高效液相色譜梯度洗脫測定維生素D3和β-胡蘿卜素。

以上實驗都在避光環(huán)境下進(jìn)行。

表1 維生素D3和β-胡蘿卜素梯度洗脫程序

圖1 皂化溫度的選擇

圖2 皂化時間的選擇

1.5 色譜條件

1.5.1 正相高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-SIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：正己烷+環(huán)己烷（1+1）并按體積分?jǐn)?shù)0.8%加入異丙醇；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：500 μL；VWD檢測器波長：0 min選擇450 nm，7 min切換成294 nm，在3～6 min收集β-胡蘿卜素，在12～15 min的收集維生素D3，收集于同一試管中。

1.5.2 反相高效液相色譜條件

1.5.2.1 維生素A和E的測定

色譜柱：Agilent Poroshell 120 PFP（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相：甲醇+水（88+12）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；DAD檢測器波長：325、296 nm。

1.5.2.2 維生素D3和β-胡蘿卜素的測定

色譜柱：Agilent Poroshell 120 PFP（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相：甲醇+水；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；DAD檢測器波長：450 nm和264 nm；梯度洗脫見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化溫度的選擇

乳粉中蛋白質(zhì)含量為60%左右，考慮到要檢測的維生素可能被蛋白包裹，需要對奶粉進(jìn)行皂化處理，皂化溫度很可能會影響各種維生素的提取率?，F(xiàn)取同時含有維生素A、維生素E、維生素D3和β-胡蘿卜素的嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行實驗，分別在55、65、75、85 ℃及95 ℃下皂化30 min，其他條件同1.4一致，重復(fù)做3次實驗，計算平均結(jié)果，結(jié)果如圖1所示，溫度從55 ℃升到85℃時，樣品中各種維生素檢出值都有不同程度的提升，但溫度從85 ℃升到95℃時，樣品中各種維生素的檢出值都基本保持不變，因此選擇皂化溫度為85 ℃。

2.2 皂化時間的選擇

皂化時間的長短對維生素的檢出值也有一定影響，時間太短皂化不完全，目標(biāo)物可能依然被包裹，時間太長，既浪費時間又有可能使目標(biāo)物氧化或分解，增加了不可控因素?，F(xiàn)取同一樣品分 別 皂 化10、20、30、40 min及50 min，其他條件同1.4一致，重復(fù)做3次實驗，計算平均結(jié)果，結(jié)果如圖2所示，皂化時間從10 min延長到30 min時，樣品各個目標(biāo)物的檢出量都有不同程度的提高，從30 min延長到50 min，樣品各個目標(biāo)物的檢出量基本保持不變，因此選擇皂化時間為30 min。

2.3 萃取溶劑的選擇

為了選擇適合各種維生素的萃取溶劑，取同一樣品，按1.4的實驗方法皂化，分別用石油醚、正己烷、石油醚+乙醚萃進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，計算平均結(jié)果，結(jié)果如圖3所示，用石油醚+乙醚萃取時，樣品各個目標(biāo)物的檢出量都為最高，因此選擇使用石油醚+乙醚進(jìn)行萃取。

圖3 萃取溶劑的選擇

圖4 維生素D3和β-胡蘿卜素標(biāo)樣和樣品圖譜（正相）

圖5 維生素A和維生素E標(biāo)樣和樣品圖譜

圖6 維生素D3和β-胡蘿卜素圖譜（反相）

2.4 色譜條件的選擇

2.4.1 正相液相色譜條件的選擇

流動相參考GB 5009.82-2016[13]選擇正己烷+環(huán)己烷（1+1），并按體積分?jǐn)?shù)0.8%加入異丙醇；柱溫會影響各物質(zhì)的保留時間，柱溫太高時，各物質(zhì)出峰太快，目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離度不夠，接收餾分時，雜質(zhì)干擾太大，不利于反相液相色譜分離；柱溫太低時，各物質(zhì)出峰時間太晚，導(dǎo)致資源浪費，同時也降低了檢測效率，25℃剛好能滿足實驗要求；β-胡蘿卜素和維生素D3餾分接收時間太短會導(dǎo)致接收不完全，時間太長接收的雜質(zhì)太多，不利于反相液相色譜分析，標(biāo)樣和樣品各物質(zhì)的保留時間如圖4所示，經(jīng)過驗證，在3～6 min內(nèi)接收β-胡蘿卜素餾分，在12～15 min內(nèi)接收維生素D3餾分，按1.4步驟處理后能滿足實驗要求。

2.4.2 反相液相色譜條件的選擇

流動相參考GB 5009.82-2016[13]選擇甲醇+水；維生素A和維生素E的測定采用等度洗脫，流動相中甲醇的比例太高或太低都會影響雜質(zhì)和各目標(biāo)物之間的分離度，選擇甲醇+水（88+12）洗脫，標(biāo)樣和樣品圖譜如圖5所示，各目標(biāo)物之間的分離度良好，樣品基本無雜質(zhì)干擾，定量準(zhǔn)確。維生素D3和β-胡蘿卜素的測定采用梯度洗脫，對極性相差大的目標(biāo)物采用等度洗脫時，目標(biāo)物的峰型差而且分離度不好、分析速度慢，采用如表1所示的梯度洗脫程序，標(biāo)樣和樣品圖譜如圖6所示，維生素D3和β-胡蘿卜素的峰型和分離度良好，樣品基本無雜質(zhì)干擾，分析速度快。

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

本研究對3個品牌一共30批次的嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行測定，維生素A含量為 450～ 520 μg/100 g、維生素 D3含量為7.8～12 μg/100 g、維生素E含量為4.8～ 8.2 mgα-TE/100 g、β-胡蘿卜素含量為59～96 μg/100 g。含量均符合國家要求。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 線性范圍和檢出限

以上述各種物質(zhì)的峰面積和濃度計算回歸方程，選擇最優(yōu)的條件下進(jìn)行實驗，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 3；通過S/N=3計算得出奶粉中維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚、維生素D3及β-胡蘿卜素的檢出限，結(jié)果如表2所示。

2.6.2 回收率和精密度

各類維生素都選擇3個水平加標(biāo)，每個水平做6次加標(biāo)回收實驗，各類維生素平均回收率均在95.2%～98.5%；對各類維生素每個水平的6次加標(biāo)回收實驗的實驗結(jié)果進(jìn)行精密度計算，各類維生素的精密度均在1.5%～4.7%。以上結(jié)果如表3所示。

表2 檢出限和線性范圍

表3 回收率和精密度

3 結(jié)論

本文對嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D3、E和β-胡蘿卜素測定過程中的皂化溫度、皂化時間、萃取溶劑和儀器色譜條件等因素進(jìn)行研究后，建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D3、E和β-胡蘿卜素的方法。樣品經(jīng)皂化處理后，用石油醚+乙醚萃取、定容，取一部分萃取液濃縮后，直接上反相液相色譜，測定維生素A和維生素E，另一部分濃縮后，先上正向液相色譜凈化，根據(jù)保留時間收集維生素D3和β-胡蘿卜素餾分，再次濃縮后上反相液相色譜測定維生素D3和β-胡蘿卜素。該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，能滿足檢測要求。適用于嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D3、E和β-胡蘿卜素含量的測定。