張利平，黃振東，蒲占胥，鹿連明

(浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318026)

柑橘黃龍病是柑橘產業(yè)上毀滅性的病害，由韌皮部難養(yǎng)桿狀菌引起，病原菌有亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus，CLas)、非洲種(Ca.L.africanus，CLaf)和美洲種(Ca.L.americanus，CLam)3個種，通過嫁接和木虱傳播[1-5]；由于病原菌的侵入導致柑橘微觀組織結構發(fā)生變化，感病葉片氣孔凹陷萎縮，氣孔周圍組織變得粗糙不平整，柵欄組織細胞排列疏松、有較大的間隙；病株果蒂細胞變的大小不均勻，部分細胞皺褶扭曲變形，細胞間隙變大，果蒂的部分維管束堵塞[6]；由于病原菌的侵入導致柑橘代謝發(fā)生變化，甜橙染病后，地上部出現(xiàn)淀粉積累，地下部分則發(fā)生淀粉欠缺[7]，長鏈脂肪酸POA、OA、ALA、ARA降低[8]，同時植株激素也有變化，花后7和12個月的病果產生的乙烯減少，但在有癥狀果實花柱端、中部或莖端果皮中，IAA和ABA含量比無癥狀感病果實和正常果實高[9]，因此植株在感染病菌后，微觀結構及微生態(tài)環(huán)境都有所改變。

植物內生真菌是全部生活史或者部分生活史在植物組織內且不會對植株造成不良影響的真菌。內生真菌與植物存在一個平衡點，一旦平衡被打破，內生真菌與植物的共生關系就會被打破[10]，植物體內的內生真菌種群有可能發(fā)生變化。本文以溫州蜜柑為研究對象，研究了感染黃龍病柑橘植株的內生真菌的多樣性及與健康植株的差異，旨在為黃龍病的防治及病理研究提供一定基礎?，F(xiàn)將有關試驗結果總結和報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

溫州蜜柑黃龍病植株和健康植株均采自柑橘所橘園內，樹齡均為20 a，采集結紅鼻子果的橘樹病株，健康植株是秋季結正常果實，且經過定量PCR鑒定為黃龍病菌為陰性的植株。分別采集病株和健康植株5株樹，每株樹上東南西北中5個方位采集葉片10片。

1.2 樣品消毒分離與保存

采集的葉片自來水沖洗干凈后，撕取葉片中脈，先在75%酒精中浸泡45 s，3%次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min，然后75%酒精中浸泡45 s，無菌水沖洗5～6次，在超凈工作臺上無菌剪刀將葉片中脈剪成1 cm左右的小段，置于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1周后出現(xiàn)菌落，切取菌落邊緣純化，經過多次純化后得到純的菌落，純的菌落斜面保存于4 ℃冰箱。

1.3 真菌分子鑒定

1.3.1 DNA提取

刮取菌落表面菌絲于液氮中研磨，研磨后將100 mg粉末裝于1.5 mL離心管中，利用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒(Protocol-II)取真菌DNA。

1.3.2 PCR擴增及測序

引物為ITS1/ITS4/ITS5通用引物(序列為5-′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)；擴增體系是50 uL，包括PremixTaq(EX)酶25 μL、10 μm引物1，3 μL、10 μm引物2，3 μL滅菌水17 μL，真菌DNA 2 μL，設置陰性對照和陽性對照，陰性對照是清水做模板，陽性對照是已知真菌DNA。擴增程序依次是：95 ℃ 3 min，1個循環(huán)；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min，1個循環(huán)，重復3次。PCR產物直接送測序公司純化測序，測序公司分別是賽默飛蘇州測序部和寶生物大連生物工程有限公司，測序的儀器是ABI3730，測序為雙向測序，得到的序列利用DNASTAR 7.1 Seqman拼接校對，校對后的序列在Blast比對，根據(jù)相似度確定種屬，序列均提交到NCBI上。登錄號見表1。

2 結果與分析

由表1可知，病株共分離到內生真菌21株，經鑒定隸屬于11個屬，其中炭疽菌屬有9株，是優(yōu)勢菌群；輪層炭殼菌屬和鏈隔孢屬分別有2株，其他屬均1株。健康植株共分離到內生真菌35株，經鑒定屬于18個屬，其中炭疽菌屬有7株，光黑殼屬和黑孢霉屬分別有4株，炭角菌屬和枝孢霉屬分別有3株，小從殼屬有2株，其他屬均1株，感病植株的內生真菌數(shù)量和種類均少于健康植株，病株和健株都有炭疽菌屬，且均為優(yōu)勢菌群，都有鏈隔孢屬、半殼孢屬(Leptostromasp.)和葉點霉屬(Phyllostictacapitalensis)，病株有2株鏈隔孢屬，健株有1株。

表1 柑橘健康植株和病株內生真菌比較

3 討論

內生真菌與寄主是互惠共生的關系，有些內生真菌可以促進植物營養(yǎng)吸收，有些可以提高植物抗生物逆境和非生物逆境的能力，有些內生真菌可刺激植物產生活性物質等[10]。柑橘植株感染黃龍病后在基因轉錄水平、蛋白質水平、代謝水平及顯微結構上發(fā)生了一系列變化，淀粉在帶病成熟葉中大量積累，基因DPE2和MEX1被下調表達，這兩個基因與淀粉分解代謝相關，蛋白表達也有差異，幾丁質酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、脂氧合酶和4個miraculin類似蛋白在感病甜橙葉片樣品中表達提高3.6～13.7倍[11]；柑橘體內的內生真菌當植株感染黃龍病后對植株有什么影響，是變成了致病菌還是在幫助植株對抗黃龍病菌，植物啟動的應答反應是不是也有內生真菌參與其中，這些有待于進一步研究。