孫 紅,楊小明

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

白果含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、內(nèi)酯類化合物、礦物質(zhì)元素、胡蘿卜素、維生素、銀杏酸、銀杏醇、銀杏黃素、銀杏黃酮等活性成分,研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗糖尿病、降壓、抗菌等活性功能療效[1],白果作為傳統(tǒng)食品已經(jīng)食用了數(shù)千年,并被加工成各種食品[2]。白果蛋白(ginkgo seed protein,GSP)作為白果內(nèi)主要活性成分之一,由白蛋白(41.9%)、球蛋白(48.68%)、醇溶蛋白(1.21%)、堿性谷蛋白(3.98%)組成,具有抗氧化、抗菌等活性功能[3-4]。鄧乾春等[5]報(bào)道,GSP中的白蛋白在一定程度上能延緩小鼠D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老和自然衰老過程,其機(jī)制可能與提高免疫功能和抗氧化能力有關(guān)。同時(shí),GSP可增強(qiáng),GSP可引起I型過敏反應(yīng),致敏物主要是分子量為32 kDa的糖蛋白。所以,降低或去除白果蛋白的致敏性是其大規(guī)模運(yùn)用的前提。

食品蛋白質(zhì)的致敏性與其抗原表位密切相關(guān),降低蛋白的免疫原性可以降低蛋白引發(fā)致敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。蛋白質(zhì)的抗原表位與其構(gòu)象表位密切相關(guān),破壞其構(gòu)象表位能極大降低其抗原表位識(shí)別率。蛋白質(zhì)構(gòu)象表位可被高溫、高壓、酶解破壞,而這些操作也是去除食品蛋白致敏性的常用工藝[10]。周昊等[11]研究發(fā)現(xiàn),300～700 MPa的高靜壓可通過破壞白果蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),顯著降低其致敏性。同時(shí),堿性蛋白酶和胃蛋白酶處理白果蛋白并分別處于300、400 MPa時(shí),白果蛋白也能得到很好的脫敏效果[12]。而有關(guān)糖基化法改變白果蛋白抗原表位、降低其致敏性的研究鮮有報(bào)道,故本文嘗試糖基化法降低白果蛋白免疫原性的可行性。

糖基化反應(yīng)是蛋白質(zhì)的氨基和還原糖的羥基之間發(fā)生一系列非常復(fù)雜的非酶促反應(yīng),它能夠影響食品的風(fēng)味、顏色、質(zhì)地以及營(yíng)養(yǎng)等品質(zhì)[13]。同時(shí),有研究報(bào)道糖基化反應(yīng)也能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的免疫原性產(chǎn)生影響。譚振等[14]在65 ℃、75%相對(duì)濕度,蛋白質(zhì)與糖的摩爾比為1∶14的條件下處理60 h,大豆球蛋白的免疫原性約降低80%。楊崢等[15]發(fā)現(xiàn),牛乳蛋白與低聚糖糖基化后,其免疫原性可降低15%。Bu等[16]發(fā)現(xiàn),β-乳球蛋白與葡萄糖以1∶2.59的比例,在51.8 ℃處理75.7 h,可降低β-乳球蛋白99.68%的致敏性。Lagemaat等[17]采用低聚果糖對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行糖基化,在95 ℃加熱1 h可減少其90%的免疫原性。所以,采用糖基化法降低白果蛋白致敏性是可行的。同時(shí),紫外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和圓二色譜等儀器分析已經(jīng)被用于檢測(cè)蛋白糖基化效果,并用于探究糖基化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響[16,18-21]。

因此,本文以免疫原性降低程度為優(yōu)化指標(biāo),優(yōu)化GSP糖基化參數(shù),并借助紫外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和圓二色譜分析免疫原性降低和GSP結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白果 由江蘇大學(xué)藥學(xué)院鑒定及保存;小鼠 由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SYXK(Jiangsu)2013-0036);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Bovine serum albumin Sigma Company;其他化學(xué)試劑 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Sartorius萬分之一電子天平 北京賽多斯依稀系統(tǒng)有限公司;7200型分光光度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司;瓦里安Cary100型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安技術(shù)有限公司;CARY ECLIPSE型熒光分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安技術(shù)有限公司;JASCO J-815型圓二色譜 日本分光公司;3110-P1000型移液槍 德國(guó)Eppendorf;HVE-50高壓滅菌鍋 HIPRYAMA制造公司;冷凍離心機(jī)BR-4 法國(guó)JOUAN公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GSP的制備 GSP的制備參考楊劍婷等[7]的方法,并略作改動(dòng)。白果去果殼,冷凍干燥36 h后,研磨成粉,并過40目篩,得到白果粉。使用石油醚對(duì)白果粉進(jìn)行脫脂,重復(fù)3～4次,直到白果粉呈白色后,自然沉降,棄去上層石油醚。待石油醚完全揮發(fā),將脫脂的白果粉與TBS(tris buffered saline,0.2 mol/L,pH=7.4)按1∶10 (m/v)的比例混合,4 ℃攪拌24 h,5000 r/min離心15 min,得到上清液。在上清液內(nèi)加入硫酸銨,提取硫酸銨飽和度在40%～80%的蛋白,5000 r/min離心30 min,得到沉淀蛋白。在沉淀蛋白內(nèi)加入適量TBS(0.01 mol/L pH=8.0),使用3.5 kDa透析袋,于0.01 mol/L pH=8.0的TBS中4 ℃透析24～36 h。將脫鹽后的GSP溶液進(jìn)行冷凍干燥,并于-20 ℃保存。

1.2.2 抗GSP血清的制備 取20只健康雄性KM小鼠,6～8周,體重在18～22 g。經(jīng)過一周適應(yīng)期后,隨機(jī)挑選15只作為GSP組,其余5只作為陰性對(duì)照組。配制100、200 mg/mL GSP溶液分別作為GSP組的致敏劑和激發(fā)劑,以0.2 mol/L pH=7.4 TBS做為陰性對(duì)照組的致敏劑和激發(fā)劑。GSP組在第1、7、14 d,以30 μL/g體重的致敏劑進(jìn)行灌胃致敏,并在第21 d以相同計(jì)量進(jìn)行激發(fā);陰性對(duì)照組在相同時(shí)間,以相同劑量進(jìn)行致敏和激發(fā)。兩組在激發(fā)后1 h進(jìn)行眼眶取血,室溫靜置3 h后,在4 ℃以1000 r/min離心10 min獲取血清。取5 mL血清與等量的生理鹽水混合,緩慢加入硫酸銨至終濃度為20%,充分混合后,4 ℃放置30 min后,于3000 r/min離心20 min,棄沉淀。上清液中繼續(xù)加硫酸銨至濃度為50%,4 ℃放置30 min,經(jīng)5000 r/min離心30 min,將收集的沉淀復(fù)溶于10 mL的生理鹽水中。然后,加入硫酸銨至終濃度為33%,4 ℃放置30 min,后于3000 r/min離心20 min,沉淀以33%飽和度的硫酸銨溶液洗滌2次后,溶解于10 mL生理鹽水中,置于透析袋中在生理鹽水中透析過夜,隨后收集血清,用于IgG測(cè)定。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA,enzyme-linked immunosorbent)檢測(cè)法的建立 采用間接ELISA測(cè)定lgG。ELISA的制備方法如下:a.樣品用PBS(1/15 mol/mL pH=8.0)配制為50 μg/mL,每孔加入100 μL,37 ℃孵育2 h,用PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗板5次,每次3 min;b.每孔加入200 μL封閉液BPBST(含1%BSA、0.05% Tween-20的PBS),濕盒中37 ℃孵育2 h,后同上洗板;c.每孔加入100 μL稀釋400倍的血清,37 ℃孵育2 h,同上洗滌;d.每孔加入100 μL稀釋200倍的羊抗鼠IgG-HRP二抗,同上洗滌;e.加入適量底物DAB于37 ℃顯色30 min,每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng),使用酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm下吸光值。陰性對(duì)照用PBS代替樣品。

1.2.4 GSP糖基化反應(yīng)的工藝優(yōu)化 使用PBS將GSP配制為2 mg/mL的樣品液。固定糖基化條件為蛋白與葡萄糖比例1∶3、糖基化溫度70 ℃、糖基化時(shí)間40 min,改變其一設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn),采用ELISA檢測(cè)法檢測(cè)GSP免疫原性,分別研究蛋白與葡萄糖比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、糖基化溫度(30、50、70、90、120 ℃)及糖基化時(shí)間(10、30、60、90、120 min)對(duì)GSP免疫原性的影響。

1.2.5 接枝度的測(cè)定 采用鄰苯二甲醛[22](OPA)方法檢測(cè)接枝度(DG)。首先,稱取40 mg OPA,溶解于1 mL甲醇中,加入2.5 mL 20% SDS溶液、25 mL 0.1 mol/L硼砂溶液及100 μLβ-琉基乙醇,用蒸餾水定容50 mL。將200 μL的樣品溶液(蛋白含量為2 mg/mL)加入到4 mL OPA試劑中渦旋振蕩,35 ℃下反應(yīng)2 min,在340 nm下檢測(cè)吸光值,來計(jì)算游離氨基含量。樣品接枝度的計(jì)算如下:

式中:A0表示GSP與葡萄糖以一定比例混合后立即在340 nm的吸光值;A1表示GSP與葡萄糖進(jìn)行接枝反應(yīng)后在340 nm的吸光值。

1.2.6 褐變程度的測(cè)定 使用0.1% SDS溶液將樣品溶液稀釋至蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%,10000 r/min離心20 min除去不溶物,以不加樣品的SDS溶液做空白,采用分光光度計(jì)在420 nm下測(cè)定吸光度A420,以A420表示褐變強(qiáng)度[23]。

1.2.7 紫外光譜的測(cè)定 采用單因素優(yōu)化后的參數(shù)對(duì)GSP進(jìn)行糖基化反應(yīng),其樣品溶液以10000 r/min離心20 min除去不溶物。采用Bradford法測(cè)定水溶蛋白含量[24],使用PBS將糖基化和未糖基化樣品稀釋為1 mg/mL。用紫外分光光度計(jì)在200～350 nm波長(zhǎng)范圍下掃描各樣品。

1.2.8 熒光光譜的測(cè)定 采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的參數(shù)對(duì)GSP進(jìn)行糖基化反應(yīng),其樣品溶液以10000 r/min離心20 min除去不溶物,使用PBS將糖基化和未糖基化樣品稀釋為1 mg/mL。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)300～450 nm,激發(fā)狹縫寬為5 cm,發(fā)射狹縫寬為2.5 cm條件下掃描各樣品。

1.2.9 圓二色譜的測(cè)定 采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的參數(shù)對(duì)GSP進(jìn)行糖基化反應(yīng),其樣品溶液以10000 r/min離心20 min除去不溶物,使用PBS將糖基化和未糖基化樣品稀釋為1 mg/mL。在常溫(25±1) ℃下,掃描速度為50 nm/min,掃描波長(zhǎng)范圍為190～250 nm,樣品池光程為0.1 nm,靈敏度為100 mdeg/cm。用平均摩爾橢圓率[θ]來表示CD數(shù)據(jù),單位為deg·cm2·dmol-1,進(jìn)行圓二色譜分析。通過CDPro軟件分析CD色譜圖數(shù)據(jù),采用CON-TIN/LL算法計(jì)算蛋白質(zhì)中各二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)交及無規(guī)則卷曲的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值作為最終結(jié)果。采用SPSS軟件,ANOVA 法評(píng)估數(shù)據(jù)的差異顯著性,差異性水平設(shè)定為p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫期間血清內(nèi)IgG含量變化

圖1為免疫期間血清內(nèi)IgG含量的變化。如圖1所示,經(jīng)白果蛋白免疫和激發(fā),小鼠體內(nèi)IgG水平顯著升高(p<0.05),說明白果蛋白具有免疫原性。同時(shí),血清內(nèi)產(chǎn)生的IgG可作為體外白果蛋白免疫原性變化的檢測(cè)一抗。

圖1 免疫期間血清內(nèi)IgG含量的變化

2.2 不同蛋白與葡萄糖比例的糖基化對(duì)GSP免疫原性的影響

由圖2a可以看出,蛋白/糖比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10時(shí),相對(duì)蛋白糖比為1∶0時(shí),GSP免疫原性分別降低了15.31%、20.24%、35.10%、36.42%和34.45%。隨著葡萄糖的比例逐漸增加且蛋白/糖比例未超過1∶3時(shí),GSP免疫原性隨著葡萄糖比例增加明顯下降。由于葡萄糖比例增大,反應(yīng)體系粘度上升,分子流動(dòng)性和擴(kuò)散性變差,蛋白與葡萄糖糖空間阻礙變大,則反應(yīng)程度降低,影響接枝反應(yīng)[25]。蛋白/糖達(dá)到1∶3、1∶5、1∶10時(shí),GSP的免疫原性則無顯著性差異,穩(wěn)定在葡萄糖比例為1∶3的水平。

由圖2b所示,增加葡萄糖且蛋白/糖比例不超過1∶3時(shí),接枝度隨著葡萄糖添加量增加顯著升高,并在蛋白/糖比為1∶3時(shí)達(dá)到最高值25.20%。繼續(xù)增加葡萄糖含量,則引起反應(yīng)體系粘度增加,而不利于接枝反應(yīng),故蛋白/糖比例達(dá)到1∶5、1∶10時(shí),接枝度顯著降低(p<0.05)。但GSP褐變程度未隨著葡萄糖添加量增加而加深,說明70 ℃反應(yīng)40 min并不會(huì)引起GSP與葡萄糖出現(xiàn)明顯美拉德褐變。

圖2 不同的蛋白/糖比例對(duì)GSP免疫原性及接枝度和褐變程度的影響

因此,結(jié)合GSP免疫原性降低程度和接枝程度,確定GSP/葡萄糖比例為1∶3。

2.3 不同糖基化溫度對(duì)GSP免疫原性的影響

如圖3a所示,糖基化溫度為30、50、70、90、120 ℃時(shí),相比室溫,GSP免疫原性分別降低了0.08%、3.60%、37.86%、43.14%和60.04%。如圖3b所示,在0～90 ℃范圍內(nèi),隨著糖基化溫度增加,GSP-葡萄糖復(fù)合物的接枝度逐漸增加,并在90 ℃達(dá)到峰值28.7%,且未發(fā)生明顯褐變。當(dāng)溫度達(dá)到120 ℃時(shí),GSP-葡萄糖復(fù)合物的接枝度出現(xiàn)顯著下降(p<0.05),并發(fā)生顯著褐變(p<0.05),這可能是由于反應(yīng)過程中較高的溫度可以提供更多的能,使反應(yīng)的速度加快,導(dǎo)致褐變強(qiáng)度增加[26]。糖基化溫度為120 ℃時(shí),GSP的免疫原性最低,但嚴(yán)重褐變引起的絮凝沉淀會(huì)降低GSP消化吸收率[27]。因此,選擇90 ℃作為較佳糖基化溫度。

圖3 不同糖基化溫度對(duì)GSP免疫原性及接枝度和褐變程度的影響

2.4 不同糖基化時(shí)間對(duì)GSP免疫原性的影響

如圖4a所示,相對(duì)未糖基化GSP,糖基化時(shí)間為10、30、60、90、120 min,GSP免疫原性分別降低了6.10%、30.52%、53.40%、54.08%和57.92%。在60 min內(nèi),隨著糖基化時(shí)間增加,GSP免疫原性逐漸降低。當(dāng)糖基化時(shí)間達(dá)到60 min以后，GSP免疫原性變化不顯著。如圖4b所示,GSP-葡萄糖復(fù)合物的接枝度在0～60 min內(nèi),隨著糖基化時(shí)間增加,其接枝度逐漸增加,并在60 min達(dá)到峰值30.1%。當(dāng)糖基化時(shí)間超過90 min時(shí),接枝度隨著時(shí)間增加而降低。同時(shí),在60 min內(nèi)糖基化反應(yīng)未引起明顯褐變,但糖基化時(shí)間達(dá)到90 min時(shí),糖基化會(huì)引起嚴(yán)重褐變。長(zhǎng)時(shí)間糖基化引起蛋白質(zhì)發(fā)生變性聚集,導(dǎo)致反應(yīng)基團(tuán)包裹在分子內(nèi)部,且蛋白空間結(jié)構(gòu)中存在大分子立體效應(yīng),進(jìn)而影響接枝物的生成[28]。所以,較佳的糖基化時(shí)間為60 min。

圖4 不同糖基化時(shí)間對(duì)GSP免疫原性及接枝度和褐變程度的影響

2.5 紫外吸收光譜結(jié)果

蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜(250～350 nm)與蛋白內(nèi)色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量密切相關(guān),故波長(zhǎng)250～350 nm處的紫外吸收光譜圖可顯示蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化[29]。對(duì)糖基化GSP樣品和未糖基化蛋白樣品進(jìn)行紫外吸收檢測(cè),結(jié)果如圖5所示。經(jīng)糖基化的GSP和未糖基化GSP在280 nm均有吸收峰,且糖基化可以明顯增加GSP在280 nm處的吸光值,說明糖基化引起白果蛋白構(gòu)象變化。由于蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后,其蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,一方面可能引起疏水基團(tuán)暴露,另一方面修飾基團(tuán)也可能使酪氨酸、苯丙氨酸等紫外吸收氨基酸殘基暴露,故糖基化能夠增加280 nm處的吸光值[21,30]。同時(shí),糖基化GSP較未糖基化GSP在280 nm有較強(qiáng)吸收值,也可能部分緣于蛋白質(zhì)糖基化可以產(chǎn)生輕甲基糠醛,而其在280 nm附近也有紫外吸收[31]。所以,白果蛋白的特征基團(tuán)被糖基化反應(yīng)改變,其抗原表位可能也被影響,進(jìn)而降低白果蛋白免疫原性。

圖5 糖基化反應(yīng)對(duì)GSP紫外吸收的影響

2.6 內(nèi)源熒光發(fā)射光譜結(jié)果

內(nèi)源熒光光譜是檢測(cè)過敏原蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的常用方法。用280 nm波長(zhǎng)光激發(fā)時(shí),蛋白質(zhì)的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基受到激發(fā),這些氨基酸殘基的激發(fā)能以熒光形式發(fā)射出來[32]。處于蛋白質(zhì)分子表面的發(fā)色氨基酸殘基具有350～353 nm的熒光發(fā)射峰,而包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的熒光發(fā)射峰在326～332 nm之間[33]。由圖6可以看出,GSP的熒光發(fā)色基團(tuán)主要在其表面,且其經(jīng)糖基化后,GSP在340 nm的最大吸收峰減小,說明糖基化反應(yīng)減少了表面熒光發(fā)射基團(tuán)數(shù)量,改變白果蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu),故其抗原表位改變而免疫原性降低。

圖6 糖基化反應(yīng)對(duì)GSP的內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度影響

2.7 圓二色譜結(jié)果

圓二色譜是一種測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)和多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的靈敏技術(shù)。蛋白質(zhì)圓二色光譜的遠(yuǎn)紫外區(qū)屬于肽鍵吸收范圍,反映了蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象,能直接測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通常α-螺旋在靠近192 nm有一正的譜帶,在208、222 nm處有2個(gè)負(fù)的肩峰譜帶;β-折疊在216 nm處有一負(fù)譜帶,在185～200 nm有一正譜帶;β-轉(zhuǎn)角在206 nm附近有一正譜帶;無規(guī)則卷曲在200 nm附近有一負(fù)峰,在210～230 nm有一正譜帶[34]。由圖7可見,未糖基化GSP在192 nm有一個(gè)正吸收峰,在208 nm有一個(gè)負(fù)吸收峰。當(dāng)GSP進(jìn)行糖基化反應(yīng)后,原有正吸收峰發(fā)生藍(lán)移,負(fù)吸收峰則發(fā)生紅移,且兩者強(qiáng)度均有變化,說明糖基化改變了GSP的二級(jí)結(jié)構(gòu),并影響白果蛋白的抗原表位。由表2可見,糖基化反應(yīng)增加了GSP的α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量,減少了β-折疊和轉(zhuǎn)角含量。這可能是由于共價(jià)引入單糖鏈,引起的空間位阻效應(yīng)會(huì)抑制蛋白質(zhì)分子間的聚集,使蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致無規(guī)卷曲含量增加[35]。所以,白果蛋白免疫原性的降低可能緣于糖基化反應(yīng)改變了白果蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位。

表2 糖基化后GSP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Table 2 The change about the secondary structure of GSP after glycosylation

圖7 糖基化反應(yīng)對(duì)GSP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

3 結(jié)論

采用糖基化的方法降低GSP免疫原性,在保證高效接枝度并防止劇烈褐變的前提下,單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的較佳參數(shù)為:蛋白/糖比例為1∶3,糖基化溫度為90 ℃,糖基化時(shí)間為60 min,且此工藝能有效降低GSP約54%的免疫原性。同時(shí),GSP經(jīng)糖基化后,其紫外吸收的增加、內(nèi)源熒光發(fā)射的降低以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,說明糖基化通過暴露GSP的紫外吸收基團(tuán),屏蔽熒光發(fā)射基團(tuán),改變蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而改變GSP的抗原表位,降低其免疫原性。