栗新峰,張 良,李芳芳,蘇占元,吳衛(wèi)宇,趙金松,,,*

(1.四川輕化工大學生物工程學院,四川自貢 643000;2.瀘州老窖集團有限責任公司,四川瀘州 646000;3.四川國檢檢測有限責任公司,四川瀘州 646000)

原酒入庫或交易原酒前,需要對其進行分類定級[1-2]。目前,我國原酒的質(zhì)量評價標準沒有統(tǒng)一[3-4],如何準確、科學、有效地評價原酒質(zhì)量成為今后研究的重點。

白酒的質(zhì)量差異主要是由酒中1%～2%的微量香味物質(zhì)決定的[5],研究者對其研究手段主要為感官評定法和色譜法。由于感官評定法容易受到主觀和客觀條件的影響[6-7],使得色譜法的檢測結(jié)果顯的更加嚴謹和科學。其中氣相色譜作為混合物的分離工具,對化合物的分離分析發(fā)揮了重要的作用[8-9],從1957年第一次實現(xiàn)氣相色譜和質(zhì)譜儀的聯(lián)用以來[10],氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在酒類領(lǐng)域開始了廣泛的應用[11-14],但是常規(guī)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離能力差,靈敏度和準確率低,僅靠提高柱效或提高柱選擇性又難以得到滿意的分析結(jié)果。與之不同的是氣相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(gas chromatography-quadrupole flight time mass spectra,GC-QTOF MS)因高配置的飛行時間質(zhì)譜有串聯(lián)其它質(zhì)譜實現(xiàn)多級質(zhì)譜分析的特點,再結(jié)合自身氣相色譜的高分離能力,使得GC-QTOF MS具有高分辨率、高靈敏度、高準確率的優(yōu)勢。羅銘等[15]通過GC-QTOF MS分析了土壤中的多環(huán)芳烴和農(nóng)藥殘留,表明了該方法在痕量化合物檢測當中具有高靈敏度和高可靠性。劉俊彥等[16]使用GC-QTOF MS對復雜體系中的微量苯甲醛、苯甲醇、苯乙酮與苯乙醛進行了分析,結(jié)果表明GC-QTOF MS靈敏度高,且定量準確,為GC-QTOF MS應用于復雜體系中微量物質(zhì)的分析提供了一種新的方法。李曉潁等[17]通過GC-QTOF MS建立了152種常見農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫與二級譜圖庫,提高了鑒定的可靠性并擴大了農(nóng)藥的分析范圍,證明了該方法在復雜基質(zhì)中可以進行準確鑒定。這些研究顯示,GC-QTOF MS在微量成分分析及風格特色研究領(lǐng)域有很大的優(yōu)勢,很適合像白酒這種復雜體系中微量物質(zhì)的準確研究。目前為止通過GC-QTOF MS定性和定量分析白酒原酒中的風味物質(zhì)并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計等分析方法建立原酒質(zhì)量等級評價體系的研究還未見報道。本研究旨在建立快速、簡單、準確且成本低的濃香型白酒原酒質(zhì)量等級評價方法。利用GC-QTOF MS強大的定性和定量能力在一定程度上可以很好地規(guī)避直接進樣法樣品中微量成分難以檢測的難題,也避免了樣品前處理過程中微量物質(zhì)的損失、成本增加和時間長等問題。

本文采用直接進樣法通過GC-QTOF MS對濃香型白酒原酒中的43種揮發(fā)性風味成分進行定性和定量分析,考察其分析方法的精密度、重復性和穩(wěn)定性,獲取指紋圖譜數(shù)據(jù),運用因子分析結(jié)合感官品評,以期建立濃香型白酒原酒質(zhì)量等級評價方法,對不同等級原酒進行更準確、科學、高效區(qū)分和評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10個不同等級濃香型原酒樣品 一級濃香原酒3個(NX1～NX3),二級濃香原酒3個(NX4～NX6)和三級濃香原酒4個(NX7～NX10),由四川原酒基金提供;叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸(內(nèi)標,色譜純,純度≥99.9%) 天津市津科精細化工研究所;甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、乙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、苯甲醛、糠醛、甲醇、2-丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、己醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、2-戊酮、3-羥基-2-丁酮、愈創(chuàng)木酚(標準品,色譜純,純度≥99.9%) 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司。

電子天平(220 g,0.1 mg) 賽多利斯科學儀器有限公司;Labserv-LS-0610干燥箱 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;7890B/7200Q-TOF氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀、VF-WAXms色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國安捷倫科技公司;超純水處理系統(tǒng) 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 濃香型原酒感官品評鑒定 感官品評鑒定小組由1名國家級品酒師和3名品酒員組成,按照色澤(10分)、香氣(25分)、口味(50分)、風格(15分),總分100分的標準對原酒樣品進行打分,其中總分95分以上定為優(yōu)級原酒,90～95分定為一級原酒,85～90分定為二級原酒,80～85分定為三級原酒,80分以下定為四級原酒。

1.2.2 濃香型原酒的GC-QTOF MS分析

1.2.2.1 GC-QTOF MS參數(shù)設置 吳衛(wèi)宇等[18]的方法。進樣量：1 μL;進樣分流比：20∶1;進樣口溫度：250 ℃;高純He2載氣流速：1 mL/min;升溫程序：初始溫度35 ℃持續(xù)10 min,然后以2 ℃/min升溫到120 ℃,再以5 ℃/min升溫到200 ℃,最后以10 ℃/min升溫到245 ℃,持續(xù)40 min;GC-QTOF MS接口溫度：280 ℃;EI離子源電離能量：70 eV;離子源溫度：230 ℃;四級桿溫度：150 ℃;掃描質(zhì)量范圍：29～500 m/z。

1.2.2.2 定性和定量分析 用乙醇溶液配制酯類、酸類、醛類、醇類、酮類、酚類等43種風味物質(zhì)的標準溶液,配制濃度為53.8～2427.5 mg/L。再用60%體積分數(shù)的乙醇溶液配制叔戊醇15.19 g/L、乙酸正戊酯15.10 g/L、2-乙基丁酸15.09 g/L的3種混合內(nèi)標溶液。采用直接進樣法對標樣自動進樣檢測和全掃描。然后利用計算機檢索NIST2012標準圖譜庫,確定這43種風味物質(zhì)的相對保留時間和特征碎片離子,選擇豐度高的碎片離子為定性離子進行定性分析。以混合標準品中各組分與對應內(nèi)標含量比值為橫坐標,各組分與對應內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標計算得到43種物質(zhì)的回歸線性方程進行定量分析。本文研究內(nèi)容是在本課題組前期建立的GC-QTOF MS檢測白酒中揮發(fā)性風味物方法的基礎上進行的,上述43種風味物質(zhì)標準溶液配制及定性離子和定量回歸線性方程詳情請查閱本課題組已發(fā)表的研究成果論文[18]。

1.2.2.3 樣品測定 按照上述GC-QTOF MS參數(shù)設置,采用直接進樣法,準確量取5 mL基酒樣品,然后加入100 μL混合內(nèi)標溶液,混勻后上機自動進樣檢測。

1.2.3 GC-QTOF MS分析方法的精密度、重復性和穩(wěn)定性 按“1.2.2”的實驗條件,分別從三個等級的濃香型原酒樣品中隨機各抽取一個酒樣按等體積1∶1∶1混合為一個酒樣,編號記為NX11。連續(xù)對其檢測6次,計算每種風味物質(zhì)6次檢測結(jié)果的RSD,對其精密度進行考察;取NX11酒樣分成6份進行檢測,計算每種風味物質(zhì)6次檢測結(jié)果的RSD,對其重復性進行考察;在17 ℃密封儲存下分別于1、10、20、30、40、50、60 h取NX11酒樣進行檢測,計算每種風味物質(zhì)6次檢測結(jié)果的RSD,對其60 h內(nèi)的穩(wěn)定性進行考察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

因子分析[19]可以從一些具有相關(guān)性的指標中,找出可能保留原始變量信息并且互相無關(guān)的少數(shù)綜合指標,從而實現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維和簡化,有利于后續(xù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。相對于傳統(tǒng)的原酒感官評價定級方法,通過因子分析將不同等級原酒之間的差異進行評價可以有效地避免感官評價的主觀影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 原酒感官品評結(jié)果

10個濃香型原酒樣品信息和感官品評結(jié)果見表1。

表1 原酒品評結(jié)果Table 1 The result of the evaluation of the base liquor

由感官品評專家小組對10個濃香型原酒樣品鑒定結(jié)果如表1顯示,NX1～NX3的總分在90～95分之間,評定為一級原酒。NX4～NX6的總分在85～90分之間,評定為二級原酒。NX7～NX10的總分在80～85分之間,評定為三級原酒。

2.2 原酒GC-QTOF MS分析方法的精密度、重復性和穩(wěn)定性

按“1.2.3”的實驗方法,對GC-QTOF MS測定濃香型白酒原酒中43種揮發(fā)性風味成分定性和定量分析的方法學進行精密度、重復性和穩(wěn)定性考察,計算結(jié)果見表2。從表2可以看出,在精密度實驗中43種揮發(fā)性風味物質(zhì)含量RSD范圍在0.21%～2.84%,相對保留時間RSD范圍在0.00%～0.65%。在穩(wěn)定性實驗中43種揮發(fā)性風味物質(zhì)含量RSD范圍在1.29%～2.98%,相對保留時間RSD范圍在0.00%～0.84%。在重復性實驗中43種揮發(fā)性風味物質(zhì)含量RSD范圍在0.81%～2.93%,相對保留時間RSD范圍在0.00%～0.77%?？傮w結(jié)果RSD≤2.98%,表明了該方法具有較好的精密度、重復性且在60 h內(nèi)較穩(wěn)定。

表2 GC-QTOF MS檢測原酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)方法的精密度、重復性和穩(wěn)定性Table 2 The accuracy,repeatability and stability of detection of volatile flavor substances in base liquor by GC-QTOF MS

續(xù)表

2.3 不同等級濃香型原酒樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)分析

本研究選取了上述43種濃香型白酒原酒中含量占比大且是重要呈香呈味特征風味物質(zhì)的共有成分,從10個濃香型原酒樣品中通過GC-QTOF MS對其進行定性和定量分析,結(jié)果見表3。

表3 10個濃香型原酒樣品中43種揮發(fā)性物質(zhì)成分定性和定量分析結(jié)果(mg/L)Table 3 Qualitative and quantitative results of 43 volatile substances in 10 Luzhou-flavor base liquor(mg/L)

續(xù)表

2.4 因子分析

利用SPSS 21.0對10個原酒樣品中的43種揮發(fā)性風味物質(zhì)構(gòu)成的10×43矩陣采用主成分的方法進行因子分析。

剔除掉成份矩陣中特征值小于1的主成分中最大特征向量對應的變量,然后重新進行因子分析,重復有限次后保留了23種揮發(fā)性風味物質(zhì)成分,結(jié)果保留了甲醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、油酸乙酯、乙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、愈創(chuàng)木酚,其中醇類6種,酸4種,酯類8種,醛類4種、酚類1種。對10個原酒樣品中保留的23種揮發(fā)性風味物質(zhì)成分重新進行主成分分析,分析結(jié)果見表4～表5。

表4 PCA總方差解釋Table 4 Total variance of principal component analysis

表5 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 5 Rotational component matrix

由表4可以看出,前3個主成分特征值大于1且累計貢獻率為91.324%,選取前3個主成分能夠基本反映原指標的大部分信息。由表5可以看出,戊酸乙酯、甲醇、庚酸乙酯、異丁醛、異戊醛、正己醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正戊醇、正丁醇和油酸乙酯在第1主成分上的載荷依次為0.982、0.939、0.922、0.917、0.900、0.887、0.886、0.820、0.818、0.807、0.721,載荷較高,相關(guān)性強,集中反映了濃香型原酒中酯類、醇類和醛類風味成分的信息。乙縮醛、乙醛、異戊醇、丁酸乙酯、異丁醇和己酸乙酯在第2主成分上的載荷依次為0.985、0.982、0.926、0.923、0.848、0.841,載荷較高,相關(guān)性強,主要涵蓋了濃香型原酒中醛類、醇類和酯類風味成分的信息。辛酸、戊酸、庚酸、愈創(chuàng)木酚和己酸在第3個主成分上的載荷依次為0.986、0.970、0.954、0.745、0.714,載荷較高,相關(guān)性強,主要代表了濃香型原酒中酸類和酚類風味成分的信息。

通過成分得分系數(shù)矩陣得出前3個主成分得分的表達式和主成分綜合得分評價式,如下。

F1=-0.004X1+0.16X2+0.153X3+0.046X4-0.016X5+0.138X6+0.147X7-0.027X8-0.003X9+0.012X10+0.136X11+0.038X12-0.005X13-0.046X14+0.085X15+0.125X16+0.065X17+0.016X18+0.018X19-0.026X20+0.002X21-0.02X22+0.037X23

F2=0.165X1-0.045X2-0.005X3+0.021X4+0.164X5+0.017X6+0.016X7+0.023X8+0.139X9+0.177X10-0.003X11+0.023X12+0.207X13+0.166X14-0.063X15-0.017X16+0.003X17-0.033X18+0.026X19+0.013X20-0.024X21-0.014X22-0.022X23

F3=-0004X1-0.022X2-0.083X3-0.059X4-0.009X5+0.001X6+0.020X7+0.044X8-0.007X9-0.046X10+0.053X11+0.005X12-0.082X13+0.074X14-0.015X15+0.016X16+0.008X17+0.227X18+0.112X19+0.159X20+0.237X21+0.263X22+0.100X23

F=(40.054F1+33.438F2+17.832F3)/91.324

通過上式,計算出10個基酒樣品的前3個主成分和主成分綜合值,見表6。

表6 主成分和主成分綜合值Table 6 Principal component values and composite principal component values

從表6可以看出,主成分綜合值F從大到小依次為0.98(NX3)、0.92(NX1)、0.31(NX2)、0.10(NX5)、0.10(NX6)、-0.09(NX4)、-0.49(NX9)、-0.55(NX10)、-0.57(NX8)、-0.71(NX7)。F值與感官定級結(jié)果94(NX3)、93(NX1)、90(NX2)、88(NX5)、88(NX6)、86(NX4)、82(NX9)、82(NX10)、81(NX8)、80(NX7)在數(shù)值上從大到小的順序一致,由此可見綜合值F越大,感官品評綜合得分越高,質(zhì)量等級就越好。根據(jù)表6中的數(shù)據(jù),做第一主成分對第二主成得分的投影圖,見圖1。

圖1 第一主成分對第二主成分得分PCA投影圖

由圖1可以看出,10個原酒樣品大體上分為三大類,其中NX1、NX3和NX2可以劃為一類,NX4、NX5和NX6可以劃為一類,NX7、NX8、NX9和NX10可以劃為一類,結(jié)果與專家組感官定級情況相符。同時,也對未篩選前原始數(shù)據(jù)的第一主成分對第二主成分得分做投影圖,見圖2。

圖2 原始第一主成分對第二主成分得分PCA投影圖

如圖2所示,和圖1進行對比分析,圖2與圖1結(jié)果類似,都能將10個原酒樣品分為三類,并且編號一致。結(jié)果再次表明了篩選出來的23種揮發(fā)性風味物質(zhì)能較好地表征原始43種揮發(fā)性風味物質(zhì)的信息,并能將該批次3個等級原酒進行有效分類。

2.5 原酒等級評判模型建立及準確率驗證

原酒樣品主成分綜合得分F值和對應的感官品評綜合得分之間有良好的線性關(guān)系。以原酒樣品3個主成分綜合得分F值為自變量,感官品評綜合得分(Y值)為因變量做線性回歸分析。得出擬合函數(shù)為Y=8.2329F+86.4(R2=0.9801),在原酒樣品23種風味物質(zhì)成分綜合得分F值和感官品評綜合得分之間建立了數(shù)學關(guān)系,通過原酒樣品的23種風味物質(zhì)成分的含量就可以得出感官品評綜合得分對原酒樣品的3個等級進行評判。

進一步從本批次原酒樣品中隨機抽取已經(jīng)通過專家組感官品評定級的3個等級濃香型原酒樣品21個,按照相同的實驗條件和方法,代入上述公式,對濃香型原酒等級評判模型的準確率進行驗證,統(tǒng)計結(jié)果見表7。

表7 原酒等級評判模型準確率統(tǒng)計結(jié)果Table 7 Statistical results of the accuracy of base liquor grade evaluation model

由表7可以看出該濃香型原酒等級評判模型相對于專家組感官品評定級有85.71%的準確率,基本可以滿足對原酒樣品一、二、三等級的初步評判。

3 結(jié)論

本文通過GC-QTOF MS對濃香型原酒樣品中的43種揮發(fā)性風味物質(zhì)成分進行定性和定量分析,在考察方法的精密度、重復性和穩(wěn)定性實驗中,43種揮發(fā)性風味物質(zhì)含量和相對保留時間的RSD均≤2.98%,表明了該方法具有較好的精密度、重復性且在60 h內(nèi)較穩(wěn)定。

利用因子分析從43種揮發(fā)性風味物質(zhì)成分中篩選出了23種揮發(fā)性風味組分:甲醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、油酸乙酯、乙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、愈創(chuàng)木酚,這23種揮發(fā)性風味物質(zhì)能夠較好地代表原始的43種揮發(fā)性風味物質(zhì)的大部分信息,可以將該批次3個等級原酒進行有效分類,和專家品評小組對10個濃香型白酒原酒樣品的感官品評鑒定結(jié)果一致。再進一步以這23種揮發(fā)性風味物質(zhì)的前3個主成分的綜合得分F值為自變量,以感官品評綜合得分(Y值)為因變量做線性回歸分析,建立了濃香型原酒等級數(shù)學評判模型Y=8.2329F+86.4(R2=0.9801),準確率驗證為85.71%,基本可以滿足對此類濃香型原酒3個等級的初步評判。鑒于實驗條件和酒樣有限,后續(xù)將繼續(xù)增大樣本量進一步分析,以期分析結(jié)果更加完善和準確。