劉琨毅，串俊剛，王 琪*，鄭 佳，周書來

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650000；3.五糧液集團技術(shù)中心，四川 宜賓 644000；4.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，四川 樂山 614000）

柑橘果肉中含有豐富的氨基酸、維生素、微量元素等多種健康因子[1-3]。具有增強機體免疫力、降低總膽固醇、預(yù)防心血管疾病的作用[4-5]。我國川南地區(qū)盛產(chǎn)柑橘，但由于川南地區(qū)屬于盆地和丘陵地貌，在柑橘盛產(chǎn)季節(jié)經(jīng)常遇到采摘、貯存和運輸不便的困境[6]。因此，研發(fā)出一種或多種優(yōu)良的柑橘貯藏加工技術(shù)對發(fā)展川南地區(qū)的柑橘產(chǎn)業(yè)顯得尤為重要。

發(fā)酵型柑橘果酒是將柑橘清洗、打漿、滅菌、添加酵母發(fā)酵后制得的具美容養(yǎng)顏、強身健體的果酒[7-8]。雖然發(fā)酵型柑橘果酒生產(chǎn)技術(shù)已較為成熟，但其產(chǎn)品普遍存在風(fēng)味較為欠缺、營養(yǎng)成分不足等缺陷[4，9]。

復(fù)合型發(fā)酵果酒是利用兩種或多種水果經(jīng)酵母菌發(fā)酵制成的酒品，能綜合原料所特有的香味及營養(yǎng)成分，彌補單一水果釀酒在感官特性方面所存在的缺點[10-12]。枸杞是一種藥食兩用的滋補佳品，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值[13-15]。目前，我國川西南已有部分地區(qū)種植枸杞（寧杞1號），并且獲得了不錯的經(jīng)濟效益[15]。因此，本試驗以釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）為發(fā)酵劑，通過利用單因素試驗及響應(yīng)面試驗對利用柑橘與枸杞釀造復(fù)合果酒的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，以期釀造出感官特性優(yōu)良的柑橘枸杞復(fù)合果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮柑橘、枸杞、白砂糖：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC31482：宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院菌種保藏中心；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：湖北鑫潤德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；次甲基藍（指示劑）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；SPHs-3c型精密pH計：上海理達儀器廠；XH-C型渦旋振蕩器：上海拓赫有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；W-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；JYL-C91T型豆?jié){機：九陽股份有限公司；723型可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機：鄭州長城工貿(mào)有限公司；LC-DCY-12SY氮吹儀：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

操作要點：將柑橘去皮去籽與鮮枸杞分別榨汁后，按照試驗所需的體積比進行混合，使液體體積達到100m L；隨后按初始糖度添加白砂糖，并加入亞硫酸鈉0.02%，將果汁的pH值調(diào)整為6.0，分裝入250m L的發(fā)酵瓶中巴氏滅菌30min；按體積分數(shù)接入經(jīng)擴大培養(yǎng)后的酵母菌懸液，在試驗所需的溫度條件下進行自然發(fā)酵，發(fā)酵前3 d每天需進行放氣，觀察到無氣泡產(chǎn)生后主發(fā)酵完成，倒桶后低溫貯存一段時間過濾后得到復(fù)合果酒成品。

1.3.2 單因素試驗

分別考察初始糖度（19%、22%、25%、28%、31%）、柑橘汁與枸杞汁的物料比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（V/V））、釀酒酵母接種量（1%、3%、5%、7%、9%）及發(fā)酵溫度（21℃、23℃、25℃、27℃、29℃）對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響，以確定較佳的初始糖度、物料比、釀酒酵母接種量、發(fā)酵溫度。

1.3.3 響應(yīng)面試驗

表1 柑橘枸杞復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optim ization of orange-wolfberry compound fruitwine

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取初始糖度（A）、物料比（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵溫度（D）為考察因素，以感官評分（Y）為評價指標(biāo)，根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計原理[2]，進行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，擬確定柑橘枸杞復(fù)合果酒最佳的發(fā)酵工藝條件，因素與水平見表1。

1.3.4 測定方法

總糖：采用直接滴定法[16]；總酸：采用電位滴定法[17]；酒精度：采用密度瓶法測定[18]；干浸出物：采用密度瓶法測定[19]。

感官評價：柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評價方法參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]中規(guī)定果酒的感官評價方法，并由此設(shè)定了柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評價方法，滿分100分如表2所示。試驗請21名具有品酒師職業(yè)資格證書的專業(yè)人士在學(xué)院品酒室對酒樣進行感官評價。

表2 柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of orange-wolfberry compound fruitwine

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘枸杞復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 初始糖度對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響

設(shè)定物料比（柑橘汁∶枸杞汁）1∶1、釀酒酵母接種量5%、發(fā)酵溫度25℃，考察初始糖度（19%、22%、25%、28%、31%）對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，當(dāng)柑橘枸杞復(fù)合果酒中初始糖度從19%增加至28%時，柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分也隨之增加；當(dāng)初始糖度達到28%時，柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分達到最高分，為（84.6±1.1）分。但隨著初始糖度的繼續(xù)增加，柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分開始呈現(xiàn)下降的趨勢。糖分在柑橘枸杞復(fù)合果酒發(fā)酵過程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類、酯類、醛類等物質(zhì)[11]。柑橘枸杞復(fù)合果酒在發(fā)酵過程中，可發(fā)酵性糖過少會出現(xiàn)酒體不豐滿、香味不足的現(xiàn)象，可發(fā)酵性糖過多則會造成復(fù)合果酒果香味變淡、酒精味明顯等不良現(xiàn)象。故選用初始糖度為28%用于后續(xù)試驗。

圖1 初始糖度對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響Fig.1 Effect of initialsugar content on sensory evaluation of orange-wolfberry com pound fruitwine

2.1.2 物料比對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響

設(shè)定初始糖度28%、釀酒酵母接種量5%、發(fā)酵溫度25 ℃，分別考察柑橘汁與枸杞汁比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 物料比對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響Fig.2 Effect ofmaterial ratio(orange juice∶wolfberry juice)on sensory evaluation of orange-wolfberry compound fruitwine

由圖2可知，柑橘汁與枸杞汁之比為1∶2時，感官評分達到了最高的（86.8±0.7）分，并顯著高于其他物料比時的感官評分（P＜0.05）。因柑橘汁與枸杞汁之比為1∶2時，柑橘枸杞復(fù)合果酒能結(jié)合兩種水果原料各自的風(fēng)味特點，形成令人愉悅的果香與酒香且酒體豐滿圓潤。由此選擇物料比（柑橘汁∶枸杞汁）1∶2用于后續(xù)試驗。

2.1.3 釀酒酵母接種量對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響

設(shè)定初始糖度28%、柑橘汁與枸杞汁比例1∶2、發(fā)酵溫度25℃，分別考察釀酒酵母接種量（1%、3%、5%、7%、9%）對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著試驗中釀酒酵母接種量的增加，柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。當(dāng)釀酒酵母接種量為5%時，柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分達到最高，為（86.8±0.7）分。酵母菌在發(fā)酵過程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時還會產(chǎn)生一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[13]。當(dāng)酵母菌接種量低于5%時，會造成釀酒原料不能完全發(fā)酵，進而使柑橘枸杞復(fù)合果酒出現(xiàn)酒精味不明顯、酒香不突出等不良現(xiàn)象。當(dāng)酵母菌的接種量超過5%時，柑橘枸杞復(fù)合果酒的口感偏酸且酒香不濃郁，這可能是酵母菌接種量過大造成酵母菌大量生長繁殖消耗了較多的可發(fā)酵性糖，并將部分乙醇轉(zhuǎn)換成酸類物質(zhì)。所以選擇酵母菌接種量為5%進行后續(xù)試驗。

圖3 釀酒酵母接種量對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of orange-wolfberry compound fruitwine

2.1.4 發(fā)酵溫度對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響

設(shè)定初始糖度28%、物料比1∶2、釀酒酵母接種量5%，分別記錄發(fā)酵溫度（21℃、23℃、25℃、27℃、29℃）對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation tem perature on sensory evaluation of orange-wolfberry compound fruitwine

由圖4可知，當(dāng)柑橘枸杞復(fù)合果酒的發(fā)酵溫度為23℃時，柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分最高，為（87.3±0.9）分。當(dāng)發(fā)酵溫度低于23℃時，酵母菌的生長代謝受到一定的抑制復(fù)合果酒酒體略顯寡淡，香味不濃郁。當(dāng)溫度高于23℃時，酵母菌的生長代謝較為活躍，使其發(fā)酵周期相對縮短，在此過程中反而不利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。因此，選擇發(fā)酵溫度為23℃進行后續(xù)試驗。

2.2 柑橘枸杞復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，通過Design Expert8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面法試驗，考察初始糖度（A）、物料比（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵溫度（D）4個因素對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的影響，響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 柑橘枸杞復(fù)合果酒釀造工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optim ization of orange-wolfberry compound fruitwine

經(jīng)Design Expert8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的回歸方程：

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極為顯著（P＜0.01），且失擬項檢驗不顯著（P＞0.05），表明未知因素對試驗結(jié)果的干擾較小，該試驗?zāi)Ｐ统浞謹M合試驗數(shù)據(jù)，可以用于確定柑橘枸杞復(fù)合果酒釀造的最佳工藝[20-24]。4個因素對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分影響的主次順序依次為C＞D＞B＞A，即酵母菌接種量＞發(fā)酵溫度＞物料比＞初始糖度，其中二次項A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項C對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），交互項BC對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項則對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

根據(jù)柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖5。

根據(jù)響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭表示兩因素交互作用對結(jié)果影響越大的理論[25-30]。由圖5可知，因素B與因素C之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，即因素B與因素C之間的交互作用對復(fù)合果酒感官評分的影響最大。該結(jié)果與表4方差分析所得的物料比與酵母菌接種量之間的交互作用對復(fù)合果酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）的結(jié)論相吻合。

圖5 初始糖度、物料比、接種量、發(fā)酵溫度交互作用對柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initialsugar content,material ratio,inoculum and fermentation temperature on sensory evaluation of orange-wolfberry compound fruitwine

通過Design Expert8.0.6軟件分析確定柑橘枸杞復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝條件為初始糖度27.76%、物料比1∶2.04、釀酒酵母接種量4.73%及發(fā)酵溫度23.18℃，在此優(yōu)化條件下，柑橘枸杞復(fù)合果酒感官評分的理論值為90.58分。為便于實際操作，將柑橘枸杞復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝條件改為初始糖度28%、物料比1∶2、釀酒酵母接種量5%及發(fā)酵溫度23℃，在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，驗證得到柑橘枸杞復(fù)合果酒的感官評分為（90.8±0.9）分，與理論值相近，證明該模型合理可靠。

2.3 柑橘枸杞復(fù)合果酒理化指標(biāo)

在最優(yōu)發(fā)酵條件下得到的柑橘枸杞復(fù)合果酒總糖為10.5 g/L，總酸為0.74 g/100m L，酒精度為6.9%vol，干浸出物為33.5 g/L。

3 結(jié)論

經(jīng)過響應(yīng)面試驗得到柑橘枸杞復(fù)合果酒的最優(yōu)釀造條件為：將鮮榨的柑橘汁與枸杞汁按照1∶2的比例進行混合，調(diào)整初始糖度為28%與pH值為6.0，隨后加入亞硫酸鈉0.02%，分裝入發(fā)酵瓶中巴氏滅菌30min。按5%的接種量接入經(jīng)擴大培養(yǎng)后的酵母菌懸液，于23℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵前3 d定時排氣，觀察到無氣泡產(chǎn)生后主發(fā)酵完成，倒桶后低溫貯存。在此條件下可獲得色澤亮黃、澄清透明、果香與酒香濃郁且和諧、酒體豐滿、爽口、風(fēng)格幽雅無缺的柑橘枸杞復(fù)合果酒，其感官評分為90.8分，酒精度為6.9%vol。