陳 靜，南立軍*，溫金英，李雪梅，王合意

（1.北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院，廣西 欽州 535000；2.楚雄師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000；3.楚雄師范學(xué)院 云南省高校葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，云南 楚雄 675000）

沙糖桔是柑桔類的名優(yōu)品種，富含維生素C（vitaminC，VC）及人類必需的各類營養(yǎng)元素，具有一定的保健功能[1-3]。廣西具有適合沙糖桔種植的獨(dú)特地理及氣候環(huán)境，自20世紀(jì)80年代引入沙糖桔以來，其種植面積逐年增加[4]。為了提升沙糖桔的附加值，眾多的研究學(xué)者對(duì)其精深加工產(chǎn)品作了大量的研究工作，主要集中在利用沙糖桔制作果酒，但其效果不是很理想[5]。主要原因在于柑橘酒苦味難以消除，營養(yǎng)功能單一以及香氣滋味結(jié)構(gòu)欠佳等，所以柑橘類果酒市場未能打開。鑒于此，眾多的研究學(xué)者對(duì)蘋果、雪梨、獼猴桃、黃金梨與柑橘混合發(fā)酵[6-9]進(jìn)行研究，以解決上述問題，取得了一定的成果，然而未能進(jìn)行推廣應(yīng)用。但這為沙糖桔與其他果品混合發(fā)酵制作果酒開辟了一條新的道路。

葡萄是世界最古老的果樹樹種之一[10]，葡萄主要以葡萄糖為主，含多種人體所需的氨基酸，藥用價(jià)值極高[11]。常見的葡萄加工產(chǎn)品有葡萄干、葡萄汁、葡萄酒、葡萄籽飲料、葡萄籽油等[12]。其中葡萄酒最為研究學(xué)者熱愛，主要研究內(nèi)容有釀造工藝、澄清效果、酵母純化篩選、葡萄酒成分分析[13]。何鳳梅等[14-15]對(duì)黑枸杞、藍(lán)毒、玫瑰茄、蘋果、山楂等水果與葡萄進(jìn)行了復(fù)合釀造工藝研究，在風(fēng)味以及口感上均取得一定成果。

本研究將以葡萄與沙糖桔進(jìn)行混合發(fā)酵制備復(fù)合果酒，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探索沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝、脫苦工藝以及澄清工藝，通過復(fù)合果酒的理化指標(biāo)和感官評(píng)價(jià)作為參考，確定沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的最優(yōu)工藝條件，以期得到口感、品質(zhì)、香氣平衡、滋味協(xié)調(diào)的沙糖桔葡萄復(fù)合果酒，解決沙糖桔銷售難和爛果的狀況、提高水果的附加值、豐富市場品種，為復(fù)合果酒的發(fā)展研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

沙糖桔、巨峰葡萄、白砂糖：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

焦亞硫酸鉀（SO2含量＞56%）、果膠酶（5×105U/g）：煙臺(tái)帝伯仕自釀劑有限公司；柚苷酶（1 100萬U/g）：江蘇采薇生物科技有限公司；福林酚（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純）：天津市致運(yùn)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、叔戊醇、異丁醇、異戊醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）（純度≥99.5%）：北京方程生物科技有限公司；帝伯仕18度酵母：煙臺(tái)良緣酒業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；WYT-J手持糖量計(jì)：上海儀邁儀器科技有限公司；果立方Q8榨汁機(jī)：佛山市潤物電器有限公司；Agilent7890B氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的加工工藝流程[16-18]

沙糖桔汁的制備：沙糖桔→預(yù)處理（剝皮、除去橘絡(luò)）→榨汁→酶解、滅酶→過濾→沙糖桔汁

巨峰葡萄汁的制備：巨峰葡萄→清洗→晾干→除?！鷶D碎→葡萄汁

沙糖桔汁、葡萄汁→成分調(diào)整→接種酵母→主發(fā)酵→后發(fā)酵→脫苦澄清→灌裝→果酒

1.3.2 操作要點(diǎn)[19-20]

沙糖桔汁、巨峰葡萄汁的制備：選擇成熟的沙糖桔和葡萄，沙糖桔剝皮，并把桔子辨上的橘絡(luò)去除干凈。葡萄先清洗，晾干，除梗，擠碎。沙糖桔和葡萄分別用榨汁機(jī)直接榨取葡萄汁和沙糖桔汁。

酶解處理：沙糖桔汁和葡萄汁按一定比例混合，加入果膠酶，溶解果膠。加入300mg/L硫酸銨為酵母提供銨鹽，加100～200mg/L焦亞硫酸鉀以達(dá)到殺菌作用，提高穩(wěn)定性，使酒醇香更濃郁[21]。調(diào)節(jié)果膠酶最適溫度50℃，果膠酶最適pH至3.5左右酶解2 h，果膠被酶解完全[22]，采用虹吸法得到上層澄清的果汁。

成分調(diào)整：沙糖桔和葡萄含糖較高，為使成品酒達(dá)到適當(dāng)?shù)木凭?，根?jù)水果原料的含糖量，通過添加白糖來調(diào)整發(fā)酵前果汁的總糖含量，調(diào)整初始糖度22°Bx。

主發(fā)酵：取0.1～0.5 g/kg的酵母加入5%的糖水中置于35℃的水浴鍋中保持30m in將酵母活化，于沙糖桔和葡萄混合汁中加入活化好的酵母0.2 g/kg，攪拌均勻，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至26℃，每天進(jìn)行攪拌2～3次，第5天皮渣分離用四層濾布進(jìn)行分離，主發(fā)酵期間，檢測發(fā)酵液的酒精度、總酸和還原糖等含量的變化，待發(fā)酵液的殘?zhí)橇拷抵?g/L時(shí)，主發(fā)酵結(jié)束[23]。

后發(fā)酵：主發(fā)酵結(jié)束，將分離壓榨去除果渣的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入后發(fā)酵容器中，同時(shí)補(bǔ)加30～50mg/L的SO2，于16℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行后發(fā)酵，直至還原糖不再變化時(shí)發(fā)酵結(jié)束[23]。

脫苦澄清：在后發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)原酒進(jìn)行脫苦處理，稱取一定量的柚苷酶放進(jìn)原酒中搖勻，王鴻飛等[24]優(yōu)化柚皮苷酶的工藝研究中指出，柚皮苷酶用量為0.5 g/L，果汁溫度為60℃，果汁pH值為4，作用時(shí)間為90m in，用柚皮苷酶對(duì)柑橘類果汁進(jìn)行脫苦具有良好的效果且脫苦率達(dá)90.55%。在經(jīng)脫苦后的復(fù)合果酒中添加加入為0.04%果膠酶的澄清劑，室溫內(nèi)靜置48 h左右，待酒液澄清后，取上層澄清液在紫外分光光度計(jì)上于波長680 nm處測透光率。通過硅藻土濾網(wǎng)過濾，除去懸浮顆粒及膠體雜質(zhì)，獲得復(fù)合果酒成品酒。

1.3.3 復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用單一變量控制法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以葡萄汁添加量分別為30%、40%、50%、60%、70%；帝伯仕18度酵母添加量分別為0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.3 g/kg、0.4 g/kg、0.5 g/kg；初始糖度分別為18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26°Bx?？疾炱咸阎砑恿俊⒔湍柑砑恿?、初始糖度對(duì)沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的感官品質(zhì)和理化指標(biāo)的影響。

（2）發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以葡萄汁添加量（A）、酵母添加量（B）、初始糖度（C）為自變量，以感官評(píng)分及理化指標(biāo)為考察指標(biāo)，通過3因素3水平正交試驗(yàn)，確定復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for fermentation technology optim ization of compound wine

1.3.4 復(fù)合果酒脫苦工藝優(yōu)化

（1）脫苦工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

于復(fù)合果酒中分別添加柚苷酶0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，分別置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃溫度條件，分別保持45min、60m in、75m in、90m in、105m in，考察柚苷酶添加量、溫度、時(shí)間等對(duì)復(fù)合果酒感官評(píng)價(jià)的影響。

（2）脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以柚苷酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）為自變量，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過3因素3水平正交試驗(yàn)確定復(fù)合果酒的脫苦工藝，正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 復(fù)合果酒脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonalexperiments for debittering technology optim ization of com pound wine

1.3.5 復(fù)合果酒的澄清

在單一的澄清劑對(duì)沙糖桔葡萄復(fù)合果酒澄清效果的影響的結(jié)果下，對(duì)復(fù)合澄清劑進(jìn)行復(fù)合果酒澄清效果的考察，其組合如表3所示。

表3 復(fù)合果酒復(fù)合澄清劑組合Table 3 Composition of com pound clarifying agent of com pound fruitwine

1.3.6 砂糖桔葡萄復(fù)合果酒的品質(zhì)分析

（1）感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)定小組由10名專業(yè)的感官評(píng)價(jià)員組成，評(píng)價(jià)滿分為100分，參照國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》[25]、農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》[26]，建立沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation standards for compound fruitwine

續(xù)表

（2）復(fù)合果酒脫苦工藝的感官品評(píng)

參照標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[26-28]的基礎(chǔ)上，制定了沙糖桔和葡萄復(fù)合果酒脫苦工藝的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，滿分10分，結(jié)果見表5。

表5 復(fù)合果酒苦味感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 5 Sensory evaluation standards for bitterness of compound fruitwine

（3）理化指標(biāo)的檢測

依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[29-31]，測定復(fù)合果酒的總酸、酒精度、總糖、甲醇、雜醇油、單寧指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 葡萄汁添加量對(duì)復(fù)合果酒的影響

分別取30%、40%、50%、60%、70%的葡萄汁加入沙糖桔汁中發(fā)酵，考察其對(duì)復(fù)合果酒的影響，結(jié)果見表6。

表6 葡萄汁添加量對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 6 Effect of grape juice addition on the quality of compound fruitwine

由表6可知，隨葡萄汁添加量30%～70%范圍內(nèi)增加，對(duì)復(fù)合果酒酒精度的影響和殘?zhí)橇康淖兓淮?，感官評(píng)分隨葡萄汁的添加先升高后下降，在葡萄汁添加量為50%時(shí)到達(dá)峰值，為78.4分。葡萄汁添加量越少，果酒苦、嗆喉、后苦越重，酒體顏色偏黃；總酸隨葡萄汁添加量的增加而增加，因此酸澀味越重；酒體顏色隨葡萄汁添加量的增加而越偏紅色。單寧的含量隨葡萄汁添加量的增多而上升，主要是因?yàn)閱螌幋嬖谟谄咸训谋砥ぶ衃32]。甲醇和雜醇油隨葡萄添加量增大，甲醇主要是由果膠在甲酯酶的作用下水解和甘氨酸轉(zhuǎn)換而成。因此，綜合分析可得最佳葡萄汁添加量為50%。

2.1.2 酵母添加量的確定

釀酒酵母添加量分別為0.1g/kg、0.2g/kg、0.3g/kg、0.4g/kg、0.5 g/kg，考察酵母添加量對(duì)沙糖桔葡萄復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表7。

表7 酵母添加量對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 7 Effect of yeast addition on the quality of compound fruitwine

由表7可知，復(fù)合果酒的酒精度跟隨著酵母量0.1～0.5 g/kg范圍內(nèi)，對(duì)復(fù)合果酒酒精度的影響和殘?zhí)橇康淖兓淮?，?dāng)酵母添加量為0.2 g/kg復(fù)合果酒的感官得分也達(dá)到峰值，為69.8分。酵母量超過0.5 g/kg時(shí)，發(fā)酵液中糖分主要用在酵母的繁殖上，生成的酒精度低，營養(yǎng)成分消耗過快和代謝物的產(chǎn)生，使酵母生長環(huán)境質(zhì)量下降導(dǎo)致過早衰老并產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，復(fù)合果酒中殘留的酵母味越重。因此，綜合分析可得最佳酵母添加量為0.2 g/kg。

2.1.3 最佳初始糖度的確定

初始糖度分別為18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx，考察初始糖度對(duì)沙糖桔葡萄復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表8。

表8 初始糖度對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 8 Effectof initialsugar contenton the quality ofcompound fruitwine

由表8可知，總酸隨初始糖度18～26°Bx的增加變化不大，酒精度和感官得分隨著初始糖度的增加呈上升后下降的趨勢，在糖度為24°Bx時(shí)達(dá)到峰值，感官評(píng)分為71.5分，殘?zhí)橇繛?.225 g/L，單寧含量高為473.420mg/L，甲醇含量為189.87mg/L。初始糖度＞24°Bx時(shí)，則出現(xiàn)下降趨勢，殘?zhí)歉吆可邽?.825 g/L，酵母滲透壓也增大，出現(xiàn)停滯期延長，果酒品質(zhì)下降。因此，綜合分析可得最佳初始糖度為24 °Bx。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果和分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分作為考察指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表9，方差分析見表10。

表9 復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 9 Results and analysis of orthogonalexperiments for fermentation technology optim ization of compound fruitwine

由表9可知，對(duì)于考察指標(biāo)感官評(píng)分來說，A＞B＞C，即葡萄添加量＞酵母添加量＞初始糖度，因此最佳組合為A3B1C1，即葡萄汁添加量為60%，酵母添加量為0.1 g/kg，初始糖度為20°Bx。對(duì)于考察指標(biāo)酒精度來說，C＞A＞B，即初始糖度＞葡萄汁添加量＞酵母添加量，因此最佳組合為A2B2C3，即初始糖度為24°Bx，葡萄汁添加量為50%，酵母添加量為0.2 g/kg。綜合分析，最佳發(fā)酵工藝組合為A3B1C3，即葡萄汁添加量為60%，酵母添加量為0.1g/kg，初始糖度為24°Bx。在此條件下重復(fù)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，可獲得感官評(píng)分為82.8分，酒精度為11.88%vol的復(fù)合果酒。由表10可知，葡萄添加量對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），其他因素對(duì)感官評(píng)分影響不顯著（P＞0.05）。

表10 復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonalexperiments results for fermentation technology optim ization of compound fruitwine

2.3 脫苦工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 柚苷酶添加量

圖1 柚苷酶添加量對(duì)復(fù)合果酒脫苦效果的影響Fig.1 Effect of naringinase addition on debittering effect of compound fruitwine

由圖1可知，感官評(píng)分隨著柚苷酶添加量在0.02%～0.06%范圍內(nèi)先增大后緩慢減小，添加量為0.05%時(shí)達(dá)到最大值為6.9分。當(dāng)柚苷酶用量少時(shí)，苦味物質(zhì)水解不完全，復(fù)合果酒中苦味重，用量過多時(shí)，苦味物質(zhì)雖然完全水解，但是過多的酶蛋白會(huì)引起不良反應(yīng)，從而使復(fù)合果酒的品質(zhì)受到影響。因此，最適柚苷酶添加量為0.03%～0.05%。

2.3.2 酶解溫度

圖2 柚苷酶酶解溫度對(duì)復(fù)合果酒脫苦效果的影響Fig.2 Effectof enzymatic hydrolysis temperature on debittering effect of compound fruitwine

由圖2可知，苦味感官評(píng)分隨著柚苷酶的酶解溫度45～65℃范圍內(nèi)而出現(xiàn)先升后降的趨勢，在酶解溫度60℃時(shí)達(dá)到最大值7.0分。溫度太低時(shí)，激發(fā)不了酶的活力，無法發(fā)揮酶的作用，導(dǎo)致脫苦效果不明顯；溫度太高時(shí)，使酶蛋白變性失活，從而降低脫苦效果。因此，最適酶解溫度為60℃。

2.3.3 酶解時(shí)間

由圖3可知，苦味感官評(píng)分隨著酶解時(shí)間在45～105min的范圍內(nèi)出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，酶解時(shí)間為75min時(shí)脫苦效果好，苦味感官評(píng)分最高為6.5分。酶解時(shí)間太短時(shí)，復(fù)合果酒中苦味物質(zhì)水解程度不足，脫苦效果不明顯；酶解時(shí)間過長，苦味物質(zhì)水解完全，但是會(huì)影響復(fù)合果酒的其他營養(yǎng)成分，導(dǎo)致品質(zhì)下降，影響口感。因此，最適酶解時(shí)間為75m in。

圖3 柚苷酶酶解時(shí)間對(duì)復(fù)合果酒脫苦效果的影響Fig.3 Effect of naringinase enzymatic hydrolysis time on debittering effectof compound fruitwine

2.4 復(fù)合果酒的脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以苦味感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表11，方差分析見表12。

表11 復(fù)合果酒脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 11 Results and analysis of orthogonalexperiments for debittering technology optim ization of compound fruitwine

表12 復(fù)合果酒脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 12 Variance analysis of orthogonalexperiments results for debittering technology optim ization of compound fruitwine

由表11可知，各個(gè)因素對(duì)復(fù)合果酒脫苦對(duì)效果有影響順序?yàn)镃＞B＞A，即酶解時(shí)間＞酶解溫度＞酶添加量。沙糖桔葡萄復(fù)合果酒脫苦工藝的最佳組合為A1B3C3，即酶解時(shí)間90min，酶解時(shí)解溫度90℃，酶的添加量0.03%。在此最佳脫苦工藝條件下，苦味感官評(píng)分為7.5分。

由表12可知，因素C對(duì)復(fù)合果酒脫苦效果的苦味感官評(píng)分有顯著影響（P＜0.05），因素A、B無顯著影響（P＞0.05）。

2.5 復(fù)合澄清劑對(duì)復(fù)合果酒的影響

果膠酶的添加量為0.04%時(shí)，透光率隨PVPP的增加而降低，果膠酶的添加量量為0.06%時(shí)，透光率隨PVPP的增加先下降后增大，果膠酶的添加量為0.08%時(shí)，PVPP添加量對(duì)透光率變化影響不大?？傮w上來說復(fù)合澄清劑的澄清效果更好，且果香和酒香比單一澄清劑更協(xié)調(diào)。綜合分析，果膠酶添加量為0.06%和PVPP添加量為0.02%的組合澄清效果更佳。

表13 復(fù)合澄清劑對(duì)復(fù)合果酒澄清效果的影響Table 13 Effect of compound clarifying agent on the clarification effect of compound fruitw ine

2.6 沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的質(zhì)量分析

沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的酒香更協(xié)調(diào)，酒體呈紅色，清澈透亮且色澤，酸澀適中?？偹釣?.458g/L，總糖為1.975 g/L，單寧含量為498.495mg/L，甲醇含量為229.99mg/L，雜醇油含量為211.836mg/L，理化指標(biāo)均符合果酒的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究以沙糖桔和葡萄作為原料發(fā)酵的復(fù)合果酒釀造工藝，利用單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法對(duì)發(fā)酵果酒和果酒脫苦工藝的進(jìn)一步優(yōu)化，最終得到沙糖桔葡萄復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝和最佳脫苦工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為葡萄添加量60%，酵母添加量0.1 g/kg，初始糖度24°Bx，發(fā)酵溫度為24℃，主發(fā)酵時(shí)間為8 d。最優(yōu)脫苦工藝條件為：柚苷酶添加量0.03%，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為90min；在主發(fā)酵前先進(jìn)行柚苷酶的脫苦比在發(fā)酵結(jié)束后效果要更佳。當(dāng)0.06%果膠酶和0.02%PVPP酶的組合時(shí)澄清效果最好，透光率為90.6%。