任海偉，孫安琪，任軍樂，李志忠*，范文廣，王昱，劉菲菲，沈佳莉，孫文斌

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050; 2.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心，甘肅 蘭州 730050; 3.甘肅省生物質(zhì)能與太陽(yáng)能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050; 4.西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730050)

作物秸稈是我國(guó)資源量最為豐富的大宗農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，被廣泛用于動(dòng)物青貯飼料[1]、生物能源[2-3]、活性炭制備[4]等領(lǐng)域，但由于秸稈收獲具有明顯季節(jié)性與時(shí)效性，使得如何有效銜接秸稈貯存和利用環(huán)節(jié)始終是其規(guī)?；瘧?yīng)用的限制因素。另一方面，由于我國(guó)農(nóng)耕條件和耕作習(xí)慣等因素，大多數(shù)玉米秸稈收獲時(shí)已處于萎蔫或干黃狀態(tài)，此時(shí)的秸稈已嚴(yán)重纖維化，水分和糖分大量流失，實(shí)現(xiàn)干秸稈的長(zhǎng)時(shí)間保質(zhì)貯存已成為資源化利用的重要前提。常見的規(guī)?；斩挶４娣椒ㄓ懈煞ê蜐穹ㄙA存兩類，其中機(jī)械通風(fēng)等干法貯存具有成本高、干物質(zhì)損失大、火災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)等缺陷；而濕法貯存是秸稈等生物質(zhì)原料在適宜水分和營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行厭氧密閉保存，主要依賴乳酸細(xì)菌等微生物菌群的微生態(tài)平衡來發(fā)揮腐敗菌抑制作用，這種方法作業(yè)簡(jiǎn)便、成本低、安全性高，被廣泛用于動(dòng)物飼草的跨季節(jié)貯存[5]。然而，不同收獲階段的秸稈因其理化特征差異需要選擇不同的貯存方法。一般情況下，鮮綠秸稈由于水分和養(yǎng)分較為充足，常采用直接或混合青貯，此時(shí)推薦的適宜干物質(zhì)含量約35%，而干黃秸稈的自身干物質(zhì)含量高達(dá)70%～80%，木質(zhì)纖維化程度嚴(yán)重，需要與馬鈴薯渣[6]、玉米漿[7]和花椰菜莖葉[8]等高含濕、高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混貯，才能滿足青貯對(duì)水分、糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的必要條件。我國(guó)是蔬菜種植和生產(chǎn)大國(guó)，2017年蔬菜產(chǎn)量約81000萬(wàn)t，其中約有30%尾菜(蔬菜根、莖、葉、盤等)被廢棄或填埋，資源化利用迫在眉睫。研究表明，干秸稈與白菜(Brassicapekinensis)、萵筍(Lactucasativa)葉等尾菜混合貯存能實(shí)現(xiàn)干秸稈濕法貯存，解決尾菜問題[9-10]，這種混貯模式非常適宜在西北干旱地區(qū)推廣，避免秸稈復(fù)水帶來的水資源浪費(fèi)。但由于干秸稈自身的“營(yíng)養(yǎng)缺乏”瓶頸，使其與尾菜的混貯發(fā)酵過程仍需優(yōu)化調(diào)控，從而進(jìn)一步改善貯存品質(zhì)。

適宜的微生物菌劑、酶制劑、化學(xué)試劑等添加劑能有效改善青貯品質(zhì)，其中有機(jī)酸是常用的發(fā)酵抑制劑，能在發(fā)酵初期快速降低pH值，有效抑制腐敗菌生長(zhǎng)[11]。張曉慶等[12]認(rèn)為添加甲酸能顯著降低pH值和氨態(tài)氮，得到品質(zhì)優(yōu)良的麻葉蕁麻(Urticacannabina)青貯料。郭艷萍等[13]發(fā)現(xiàn)添加乙酸能顯著提高青貯高粱(Sorghumbicolor)的乳酸含量，添加丙酸能顯著降低青貯pH值和氨態(tài)氮含量。白春生等[14]發(fā)現(xiàn)添加甲酸和丙酸能降低羊草(Leymuschinensis)青貯pH值和氨態(tài)氮含量，提高發(fā)酵品質(zhì)。李君風(fēng)等[15]認(rèn)為乙酸能改善燕麥(Avenafatua)和紫花苜蓿(Medicagosativa)混合青貯發(fā)酵品質(zhì)并提高有氧穩(wěn)定性。Schmidt等[16]發(fā)現(xiàn)添加乙酸能有效降低玉米(Zeamays)青貯pH值，防止腐敗變質(zhì)。究其原因，青貯發(fā)酵本質(zhì)上是乳酸菌等微生物菌群協(xié)同作用的動(dòng)態(tài)生化變化過程，了解貯存過程中的微生物菌群多樣性對(duì)其發(fā)酵品質(zhì)調(diào)控至關(guān)重要。近年來，高通量測(cè)序技術(shù)因其能全面準(zhǔn)確描述微生物群落和微生態(tài)信息，被廣泛用于土壤、海洋、腸道及極端生境的微生物多樣性研究，而應(yīng)用于青貯微生物的研究報(bào)道還相對(duì)較少。熊乙等[17]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析比較了全國(guó)5個(gè)主要地區(qū)牧場(chǎng)中全株玉米青貯飼料的微生物(乳酸菌、酵母菌、霉菌)多樣性。Ni等[18]利用MiSeq PE300平臺(tái)分析了乳酸菌和糖蜜添加劑對(duì)大豆青貯過程中微生物群落變化的影響，發(fā)現(xiàn)二者組合添加能提高乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度，降低梭菌屬(Clostridium)和腸桿菌屬(Enterobacter)等不良微生物豐度。Li等[19]利用MiSeq PE300研究了加入微藻對(duì)五節(jié)芒(Miscanthusfloridulus)青貯過程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌及腐敗菌等微生物菌群的影響，發(fā)現(xiàn)青貯過程中厚壁菌門是最豐富的細(xì)菌門，添加微藻后乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。Ogunade等[20]通過Illumina MiSeq分析了不同添加劑對(duì)青貯苜蓿微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌改變了青貯苜蓿的微生物組成，提高了乳桿菌屬相對(duì)豐度。

為進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)控干秸稈貯存過程，本試驗(yàn)以干玉米秸稈為原料，首先從化學(xué)組分和發(fā)酵產(chǎn)物構(gòu)成模式等方面研究了添加廢棄白菜對(duì)干秸稈貯存品質(zhì)的動(dòng)態(tài)影響，在此基礎(chǔ)上分析添加甲酸對(duì)干秸稈/廢棄白菜混貯發(fā)酵品質(zhì)的調(diào)控效果，并利用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析貯存過程中的微生物菌群動(dòng)態(tài)演繹過程，為實(shí)現(xiàn)干秸稈的高品質(zhì)、可調(diào)控、長(zhǎng)時(shí)間濕法貯存提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干玉米秸稈(dry corn stalk，DCS)收集自甘肅省定西市隴西縣，摘穗后田間留置3個(gè)月，含水量為10.23%，粉碎至0.5～1.0 cm備用；廢棄白菜(cabbage waste，CW)收集自蘭州市七里河區(qū)職工菜市場(chǎng)，含水量為91.41%，切碎至2 cm×2 cm備用；甲酸(formic acid，F(xiàn)A)等化學(xué)試劑為分析純；DNA試劑盒采用Water DNA Isolation Kit，購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司。

1.2 干玉米秸稈的貯存試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和2個(gè)混合貯存組，其中SE組為干秸稈單獨(dú)密閉貯存對(duì)照組，ME組為干秸稈與廢棄白菜混合貯存處理組，F(xiàn)B組為添加甲酸的干秸稈/廢棄白菜混合貯存處理組(表1)，甲酸添加量為0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，每組3個(gè)重復(fù)，填實(shí)密封后恒溫(18±1 ℃)連續(xù)貯存60 d(試驗(yàn)時(shí)間為2015年1月至2月)，分別于30和60 d分析其化學(xué)組分、發(fā)酵品質(zhì)和細(xì)菌多樣性。

表1 干玉米秸稈和廢棄白菜貯存試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Storage experiment design of dry corn stalk and cabbage waste based on silage theory

1.3 貯存樣品預(yù)處理及其分析方法

按照四分法稱取3份有代表性的貯存樣品20 g，其中一份以1∶9加蒸餾水混合打漿，經(jīng)4層紗布和定性濾紙過濾后3900 r·min-1離心10 min，離心后的上清液經(jīng)抽濾得澄清液，使用丹佛UB-7型酸度計(jì)測(cè)定pH后于-20 ℃凍存，用于測(cè)定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PPA)、丁酸(butyric acid，BA)、乙醇(ethanol，EA)和氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)等小分子有機(jī)物；使用SBA-40X生物傳感器(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定乳酸和乙醇含量，采用苯酚-次氯酸比色法測(cè)定氨態(tài)氮含量，采用GC9790II氣相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸等含量，總有機(jī)酸(total organic acid)包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等小分子酸[13]。

另一份樣品于105 ℃烘干至恒重，粉碎過篩(孔徑為0.45 mm)用于測(cè)定可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)、總氮(total nitrogen，TN)以及酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、中性洗滌纖維(natural detergent fiber，NDF)和酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin，ADL)等木質(zhì)纖維組分；采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定WSC[13]含量，使用F800纖維測(cè)定儀測(cè)定NDF、ADF、ADL含量，纖維素(cellulose，CL)、半纖維素(hemicellulose，HC)和綜纖維素(holocellulose，HoC)含量由公式CL=ADF-ADL、HC=NDF-ADF、HoC=CL+HC計(jì)算得出，使用K9840凱氏定氮分析儀(山東海能科技有限公司)測(cè)定總氮含量。

第3份樣品用于DNA提取和微生物多樣性分析。無菌環(huán)境下，將20 g樣品與200 mL無菌生理鹽水混合，37 ℃恒溫振蕩2 h制得菌懸液，再用孔徑0.22 μm無菌濾膜過濾得到微生物菌體。將整張帶有菌體的濾膜剪碎后置于2 mL無菌離心管中，按照Water DNA Isolation Kit 試劑盒方法提取總DNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送上海派森諾生物科技有限公司Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序分析。選定相對(duì)豐度高于0.1%的細(xì)菌制作菌群微生態(tài)分布圖，并從門、屬水平進(jìn)行微生物多樣性分析[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010軟件整理，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)不同處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加廢棄白菜和有機(jī)酸對(duì)貯存品質(zhì)的動(dòng)態(tài)影響

2.1.1干秸稈添加廢棄白菜貯存DM和WSC含量的動(dòng)態(tài) 貯存30和60 d時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組中的DM和WSC含量均顯著低于0 d(P<0.05)(表2)?；旌蠌U棄白菜后，ME和FB組2個(gè)混合貯存組中DM含量均顯著低于SE組，且貯存60 d時(shí)FB組中DM含量顯著低于ME組(P<0.05)。另外，相對(duì)于干秸稈的低WSC含量，加入廢棄白菜后混貯體系中的WSC含量顯著高于SE組(P<0.05)，達(dá)到9.53%，符合糖含量青貯必要條件范圍(8～10% DM)；但貯存30和60 d后，ME組中的WSC含量卻顯著低于SE組(P<0.05)，說明WSC組分被濕法貯存過程中的微生物菌群消耗利用；而加入甲酸的FB組中WSC含量顯著高于ME組(P<0.05)，說明加入有機(jī)酸抑制了微生物對(duì)糖的代謝利用，有利于WSC組分保存。

2.1.2干秸稈添加廢棄白菜貯存纖維組分的動(dòng)態(tài) 貯存期間3個(gè)試驗(yàn)組中的木質(zhì)纖維組分含量變化趨勢(shì)較為復(fù)雜(表3)?？傮w上看，隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)，SE和ME組中ADL含量呈先減少后增加的趨勢(shì)，HC、CL和HoC含量均呈先增加后減少的趨勢(shì)(除SE組中CL和HoC)；而FB組中ADL含量則顯著下降(P<0.05)，HC和HoC顯著增加(P<0.05)。另一方面，貯存期間2個(gè)混合貯存組中NDF含量均顯著低于SE組(P<0.05)； 且與ME組相比， FB組中NDF含量顯著減少(P<0.05)。60 d時(shí)2個(gè)混合貯存組中ADF含量顯著低于SE組(P<0.05)，且FB組中ADF含量顯著低于ME組(P<0.05)。2個(gè)混合貯存組中，ADL含量在0和30 d時(shí)均顯著高于SE組(P<0.05)；60 d時(shí)均低于SE組，且FB組中ADL含量顯著低于ME組(P<0.05)。30 d時(shí)，ME組中HC、CL和HoC含量均顯著低于SE組(P<0.05)，同時(shí)FB組中三者含量均顯著低于ME組(P<0.05)，但60 d時(shí)FB組中HC和HoC含量均顯著高于ME組(P<0.05)。

表2 貯存過程中干物質(zhì)和可溶性碳水化合物含量的動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic changes on the content of dry matter (DM) and water soluble carbohydrates (WSC) during storage

注：同列不同小寫字母表示相同時(shí)間不同處理組差異顯著(P<0.05)，同列不同大寫字母表示相同處理組不同時(shí)間差異顯著(P<0.05)。FM：鮮重。下同。

Note: The different lowercase within the same column indicate significant differences atP<0.05 between different groups at the same time, the different capital letters within the same column indicate significant differences atP<0.05 for the same groups within different time. FM: Fresh weight. The same below.

表3 貯存過程中木質(zhì)纖維組分含量的動(dòng)態(tài)變化Table 3 Dynamic changes on the content of lignocellulosic constituents during storage (%DM)

2.1.3干秸稈添加廢棄白菜貯存pH和AN/TN的動(dòng)態(tài) 貯存期間3個(gè)試驗(yàn)組中pH值均隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高(P<0.05)；ME和FB組的pH值均顯著低于SE組(P<0.05)，且FB組pH值在30 d時(shí)與ME組差異不顯著(P>0.05)，60 d時(shí)顯著高于ME組(P<0.05)(表4)。另一方面，SE組中AN/TN值隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高(P<0.05)，ME組變化差異不顯著(P>0.05)，F(xiàn)B組AN/TN值顯著下降(P<0.05)。而且，貯存期間3個(gè)試驗(yàn)組的AN/TN值均遠(yuǎn)低于優(yōu)良青貯推薦值10%。

2.1.4干秸稈添加廢棄白菜貯存發(fā)酵特性參數(shù)的動(dòng)態(tài) SE、ME和FB組中LA和AA含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)(表5)。貯存期間2個(gè)混貯組中LA含量均顯著高于SE組(P<0.05)，且ME組始終顯著高于FB組(P<0.05)；貯存期間FB組中AA含量最低，說明添加甲酸抑制了LA和AA生成。貯存期間3個(gè)試驗(yàn)組PPA含量均低于0.1%，BA含量均低于1%，處于良好青貯品質(zhì)范圍。2個(gè)混貯組中的LA/AA和LA/TOA值遠(yuǎn)高于SE組，但FB組這2個(gè)指標(biāo)低于ME組，說明有機(jī)酸抑制了乳酸發(fā)酵強(qiáng)度。

表4 貯存過程中pH和AN/TN值的變化Table 4 Dynamic changes of pH and AN/TN during storage

表5 貯存過程中發(fā)酵特性的動(dòng)態(tài)變化Table 5 Dynamic changes of fermentation profile during storage

2.2 干秸稈添加廢棄白菜貯存微生物多樣性的動(dòng)態(tài)

2.2.1門水平細(xì)菌群落分析 干玉米秸稈主要附著有變形菌門(65.26%)、厚壁菌門(33.78%)和少量擬桿菌門、放線菌門細(xì)菌，但后兩者豐度之和不足1%。廢棄白菜主要附著變形菌門(80.23%)、擬桿菌門(18.57%)和少量厚壁菌門、放線菌門、藍(lán)藻(三者豐度均<1%)門細(xì)菌(圖1)。干秸稈單一貯存(SE組)60 d期間，變形菌門細(xì)菌豐度始終保持最高值，30、60 d時(shí)分別為81.80%和64.30%；而厚壁菌門細(xì)菌豐度大幅下降至3.10%(30 d)、9.60%(60 d)。對(duì)添加白菜和甲酸的混合貯存組而言，ME組中厚壁菌門細(xì)菌豐度最高，30 d時(shí)為51.10%，60 d時(shí)增至56.60%，而FB組厚壁菌門細(xì)菌在30、60 d時(shí)的豐度分別為33.00%和56.20%。與SE組相比，ME和FB組中變形菌門細(xì)菌豐度均有所下降，30 d時(shí)豐度分別為48.30%和60.00%，60 d時(shí)豐度分別下降至40.40%和42.10%。另外，貯存期間，SE組中還存在一定量擬桿菌門細(xì)菌，30、60 d時(shí)的豐度分別為11.90%和22.00%，而ME和FB組中擬桿菌門細(xì)菌豐度均較低，介于0.50%～6.40%。

圖1 貯存過程中門水平上細(xì)菌群落組成Fig.1 The bacterial community composition in phylum level during storage DCS：干玉米秸稈；CW：廢棄白菜；SE、ME、FB的后綴1, 2分別表示貯存周期為30，60 d。下同。DCS: Dry corn stalk; CW: Cabbage waste; The suffixes with 1, 2 of SE, ME, FB: storage period for 30, 60 d respectively. The same below. Actinobacteria: 放線菌門； Bacteroidetes: 擬桿菌門； Firmicutes: 厚壁菌門； Proteobacteria: 變形菌門； Cyanobacteria: 藍(lán)藻； Others: 其他.

2.2.2屬水平細(xì)菌群落及乳酸菌多樣性分析 干玉米秸稈主要包含肉食桿菌屬(27.71%)等乳酸細(xì)菌和腸桿菌屬(47.11%)、泛生菌屬(10.14%)、耶爾森菌屬(4.76%)、微小桿菌屬(3.46%)、假單胞菌屬(2.27%)等非乳酸細(xì)菌。廢棄白菜中主要包含假單胞菌屬(48.40%)、泛生菌屬(17.10%)、黃桿菌屬(16.26%)等非乳酸細(xì)菌，乳酸細(xì)菌總豐度不足1%，含量極少(圖2和圖3)。干秸稈單獨(dú)貯存(SE組)過程中，乳酸細(xì)菌總豐度始終低于1.10%，30 d時(shí)乳酸細(xì)菌主要有乳球菌屬、腸球菌屬和肉食桿菌屬，60 d時(shí)演變?yōu)轭惾闂U菌屬和乳桿菌屬；而SE組中的非乳酸細(xì)菌總豐度在30、60 d時(shí)分別高達(dá)90.20%、84.70%，主要包括歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬、假單胞菌屬、地桿菌屬、葡萄球菌屬、金黃桿菌屬、農(nóng)桿菌屬、鞘脂單胞菌科等。此外，SE組中還存在一些未知細(xì)菌(30 d時(shí)8.70%；60 d時(shí)14.90%)。

添加廢棄白菜與干玉米秸稈混貯后，ME組中乳酸細(xì)菌多樣性較SE組變得更加豐富，主要包括乳桿菌屬、類乳桿菌屬、肉食桿菌屬、乳球菌屬、片球菌屬、腸球菌屬等細(xì)菌，其中乳桿菌屬和類乳桿菌屬豐度較高，30 d時(shí)分別為20.70%和22.90%，60 d時(shí)演變?yōu)?5.40%和15.40%，且乳酸細(xì)菌總豐度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，由30 d時(shí)49.90%增至60 d時(shí)54.90%。加入甲酸后FB組中乳酸細(xì)菌由30 d時(shí)的類乳桿菌屬(15.50%)、毛形螺菌屬(8.60%)、乳桿菌屬(4.80%)等演變?yōu)?0 d時(shí)的乳桿菌屬(25.40%)、類乳桿菌屬(21.90%)、片球菌屬(7.60%)等，乳酸細(xì)菌總豐度從30 d時(shí)30.90%上升至60 d時(shí)55%?？傊?，與SE組相比，ME和FB組中乳酸細(xì)菌多樣性變得更豐富。另一方面，2個(gè)混合貯存組中含量最高的腐敗細(xì)菌均為腸桿菌屬，30 d時(shí)豐度分別為44.90%(ME組)、49.90%(FB組)，60 d時(shí)均被有效抑制，豐度分別降至36.00%、33.10%；另外，ME和FB組還有少量地桿菌屬、歐文氏菌屬、鞘脂單胞菌科、黃桿菌屬、金黃桿菌屬等細(xì)菌。

圖2 貯存過程中屬水平上細(xì)菌群落組成Fig.2 The bacterial community composition in genus level during storage Carnobacterium: 肉食桿菌屬；Paralactobacillus: 類乳桿菌屬；Lactobacillus: 乳桿菌屬；Pediococcus: 片球菌屬；Lactococcus: 乳球菌屬；Lachnobacterium: 毛形螺菌屬；Microbacteriaceae: 微桿菌科；Flavobacterium: 黃桿菌屬；Chryseobacterium: 金黃桿菌屬；Sphingobacteriaceae: 鞘脂桿菌科；Pedobacter: 地桿菌屬；Sphingobacterium: 鞘氨醇桿菌屬；Staphylococcus: 葡萄球菌屬；Agrobacterium: 農(nóng)桿菌屬；Sphingomonadaceae: 鞘脂單胞菌科；Sphingomonas: 鞘脂單胞菌屬；Comamonadaceae: 叢毛單胞菌科；Enterobacter: 腸桿菌屬；Erwinia: 歐文氏菌屬；Pantoea: 泛生菌屬；Serratia: 沙雷氏菌屬；Pseudomonas: 假單胞菌屬；Xanthomonadaceae: 黃單胞菌科；Stenotrophomonas: 寡養(yǎng)單胞菌屬；Caulobacteraceae: 柄桿菌科；Rhizobiales: 根瘤菌科；Devosia: 德沃斯氏菌屬；Methylobacterium: 甲基桿菌屬；Novosphingobium: 新鞘脂菌屬；Sphingobium: 鞘脂菌屬；Comamonas: 叢毛單胞菌屬；Delftia: 代爾夫特菌屬；Variovorax: 貪噬菌屬；Pseudoxanthomonas: 假黃色單胞菌屬；Exiguobacterium: 微小桿菌屬；Yersinia: 耶爾森菌屬；Saccharibacillus: 糖化桿菌；Cyanobacteria norank: 諾蘭柯藍(lán)細(xì)菌；Janthinobacterium: 詹森菌屬；Duganella: 杜檊氏菌屬；Others: 其他.

圖3 貯存過程中乳酸菌屬的細(xì)菌多樣性Fig.3 The bacterial composition diversity of lactic acid bacteria (LAB) during storage Aerococcus: 氣球菌屬；Carnobacterium: 肉食桿菌屬；Enterococcus: 腸球菌屬；Paralactobacillus: 類乳桿菌屬；Lactobacillus: 乳桿菌屬；Pediococcus: 片球菌屬；Lactococcus: 乳球菌屬；Lachnobacterium: 毛形螺菌屬；Other: 其他.

3 討論

3.1 添加廢棄白菜和有機(jī)酸對(duì)干物質(zhì)和有機(jī)組分含量的影響

原料中干物質(zhì)含量多寡是影響其青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要因素之一。試驗(yàn)中，干秸稈單一貯存60 d后干物質(zhì)損失率最高為17.24%，而添加廢棄白菜和有機(jī)酸混貯后的ME和FB組中干物質(zhì)損失率分別為1.56%和3.88%，說明濕法貯存的干物質(zhì)損失率遠(yuǎn)低于單一貯存，但FB組的干物質(zhì)損失率大于ME組，原因可能是長(zhǎng)時(shí)間酸性環(huán)境和有機(jī)酸加入能促使纖維中部分非結(jié)構(gòu)性碳水化合物被降解[22]，這與Shinners等[23]報(bào)道的干法貯存干物質(zhì)損失率遠(yuǎn)高于濕法貯存結(jié)果一致。另一方面，可溶性碳水化合物(WSC)是發(fā)酵過程中微生物菌群繁殖代謝的重要底物，廢棄白菜和干玉米秸稈混貯過程中WSC含量下降較快，原因可能是混合后濕法貯存環(huán)境使乳酸菌等微生物菌群繁殖代謝活性升高，增加了糖代謝消耗量；而添加甲酸后能使pH值迅速下降，從而抑制與呼吸作用相關(guān)的植物酶和微生物菌群活性，減少WSC利用，這與李君風(fēng)等[15]報(bào)道結(jié)果基本一致。侯美玲等[24]也認(rèn)為添加甲酸可顯著提高天然牧草中WSC含量，因?yàn)樘砑蛹姿釋?duì)結(jié)構(gòu)性碳水化合物具有一定酸解作用，釋放更多的水溶性碳水化合物，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。

木質(zhì)纖維組分是秸稈干物質(zhì)的主要成分，其含量多寡直接影響秸稈的生物降解效率。試驗(yàn)中，干秸稈單一貯存期間，木質(zhì)纖維組分含量較高，依然保持干癟韌性的物理狀態(tài)，不利于秸稈降解[25]。而加入白菜或甲酸進(jìn)行濕法貯存后，干秸稈變得軟化濕潤(rùn)，木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，有利于NDF和ADF含量降低，且添加甲酸效果更顯著。張樹攀等[26]也發(fā)現(xiàn)添加甲酸對(duì)高丹草青貯料中的NDF和ADF含量有一定降低作用。另一方面，木質(zhì)素對(duì)纖維素和半纖維素具有物理性阻礙和牢固共價(jià)鍵束縛，使其降解利用的難度大大增加[27]。貯存60 d時(shí)2個(gè)混合貯存組中ADL含量均低于對(duì)照組，且添加甲酸后效果更明顯，說明長(zhǎng)時(shí)間酸性貯存環(huán)境有助于秸稈ADL組分的下降，提高生化轉(zhuǎn)化效率。這與王瑩等[28]報(bào)道甲酸處理組中ADL含量顯著降低結(jié)果一致。

3.2 添加廢棄白菜和有機(jī)酸對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

研究表明，pH值與蛋白質(zhì)降解程度密切相關(guān)，pH<4.2時(shí)蛋白質(zhì)分解為較穩(wěn)定的氨基酸，損失?。籶H>4.2時(shí)，由于梭菌等腐敗菌活動(dòng)，使氨基酸分解成非蛋白氮(氨，胺等)，造成蛋白質(zhì)損失[29]。氨態(tài)氮/總氮值(AN/TN)反映了蛋白質(zhì)和氨基酸分解程度，該值越大說明氨基酸和蛋白質(zhì)分解越多，意味著貯存質(zhì)量變差[30]。試驗(yàn)中，添加廢棄白菜和有機(jī)酸的2個(gè)混合貯存組pH和AN/TN 值均顯著低于單一貯存組，且3個(gè)試驗(yàn)組的AN/TN值均遠(yuǎn)低于良好發(fā)酵品質(zhì)閾值10%，這與侯建建等[31]報(bào)道一致。

除pH值和AN/TN指標(biāo)外，厭氧密閉貯存過程中發(fā)酵生成的有機(jī)酸及其構(gòu)成模式也是評(píng)價(jià)發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。與干秸稈單一貯存相比，添加廢棄白菜進(jìn)行濕法混合貯存的發(fā)酵方式有利于原料附著微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝利用，添加廢棄白菜和有機(jī)酸的2個(gè)混合貯存組中LA含量顯著高于對(duì)照組，但添加甲酸的FB組中LA含量始終低于ME組。這可能是因?yàn)椋环矫婕尤爰姿釋?duì)乳酸發(fā)酵反應(yīng)有直接抑制作用，另一方面甲酸的抑菌效果較弱，從而對(duì)酵母菌等微生物抑制作用微弱，少數(shù)有活性的酵母菌仍能代謝利用乳酸底物，從而使乳酸含量顯著下降[32]。榮輝等[33]認(rèn)為甲酸的抑菌作用取決于H+濃度效應(yīng)和未離解酸的選擇性抑菌效應(yīng)，高添加量(6.6 mL·kg-1)時(shí)H+效應(yīng)較強(qiáng)，能完全抑制微生物活性，從而降低乳酸生成量。另一方面，乳酸含量的升高又會(huì)對(duì)乳酸菌繁殖代謝產(chǎn)生反饋抑制作用，從而使乳酸含量隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降。乳酸/乙酸(LA/AA)反映了混貯體系中同型發(fā)酵程度的強(qiáng)弱，乳酸/總有機(jī)酸值(LA/TOA)反映了混貯體系的乳酸發(fā)酵強(qiáng)度。試驗(yàn)中，添加廢棄白菜的濕法貯存體系中乳酸發(fā)酵程度較為強(qiáng)烈，而加入甲酸后的乳酸發(fā)酵強(qiáng)度有所抑制，但這種抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)有所減弱。此外，3個(gè)試驗(yàn)組中丙酸和丁酸含量均較低，屬于優(yōu)質(zhì)青貯范圍[34]。總之，從有機(jī)酸角度來看，添加廢棄白菜和有機(jī)酸的2個(gè)混合貯存組均具有良好的發(fā)酵品質(zhì)。

3.3 添加廢棄白菜和有機(jī)酸對(duì)貯存過程中細(xì)菌多樣性的影響

干玉米秸稈貯存前的門水平優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門和厚壁菌門，其中厚壁菌門是革蘭氏陽(yáng)性菌，主要有產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，很多芽孢桿菌可以降解多種大分子化合物，如纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等[35]，變形菌門屬革蘭氏陰性菌，包括很多病原菌，如大腸桿菌等，會(huì)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)利用糖類，同時(shí)引起蛋白質(zhì)降解[36]。當(dāng)干秸稈單一貯存時(shí)，厚壁菌門豐度大幅下降，而加入廢棄白菜和有機(jī)酸混貯后，厚壁菌門豐度升高，同時(shí)變形菌門豐度下降，這可能也是2個(gè)混合貯存組中NDF和ADF含量均有所下降的原因之一。陶蓮等[36]也發(fā)現(xiàn)玉米秸稈青貯后厚壁菌門的菌群豐度顯著增加。

同時(shí)，貯存過程中乳酸菌等微生物菌群的構(gòu)成及豐度是不斷變化的。從屬水平細(xì)菌群落分析，干玉米秸稈主要含有肉食桿菌屬和腸桿菌屬等細(xì)菌，其中腸桿菌屬屬于好氧細(xì)菌，能消耗利用可溶性碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分引起秸稈腐敗變質(zhì)。干秸稈單一貯存后腸桿菌屬豐度降低，總?cè)樗峒?xì)菌豐度也大幅下降至1.10%左右，因?yàn)閱我桓山斩捹A存時(shí)的微生物生命活動(dòng)接近于生理干燥狀態(tài)，發(fā)酵活動(dòng)相對(duì)微弱。添加廢棄白菜混貯后，貯存體系中水分和糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到補(bǔ)充，達(dá)到青貯必要條件(水分含量60%～70%[22]，可溶性碳水化合物8%～10%DM)，使ME組乳桿菌屬和類乳桿菌屬等乳酸細(xì)菌的豐度明顯提高，并有效抑制腸桿菌屬腐敗細(xì)菌，使其豐度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。加入甲酸后的混貯體系中，30 d時(shí)總?cè)樗峒?xì)菌豐度有所下降，60 d時(shí)又恢復(fù)到與ME組相近，且片球菌屬豐度明顯升高。與干秸稈單一貯存(SE)組相比，ME和FB組的總?cè)樗峒?xì)菌豐度大幅升高，有效降低了發(fā)酵pH值，增加乳酸產(chǎn)量。這與陶蓮等[36]報(bào)道的玉米秸稈青貯后片球菌屬和乳桿菌屬菌群豐度顯著增加結(jié)果一致。Ogunade等[37]發(fā)現(xiàn)添加丙酸的青貯玉米中主要有乳桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、魏斯氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、沙雷氏菌屬等細(xì)菌。Dunière等[38]發(fā)現(xiàn)玉米青貯過程中主要存在類芽孢桿菌、黃桿菌科、鞘脂單胞菌屬、微小桿菌屬、根瘤菌科、不動(dòng)桿菌屬和布赫納氏菌屬等細(xì)菌。試驗(yàn)中，添加廢棄白菜和有機(jī)酸的秸稈混貯體系中主要存在乳桿菌屬、類乳桿菌屬、片球菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、地桿菌屬、鞘脂單胞菌科、黃桿菌屬、金黃桿菌屬等細(xì)菌群落，與上述報(bào)道不完全一致，這可能與原料種類、貯存溫度及檢測(cè)方法等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

相較于干玉米秸稈單獨(dú)密閉貯存，添加廢棄白菜或甲酸進(jìn)行濕法混合貯存更有利于減少原料中干物質(zhì)損失?；熨A體系中的低pH值和高有機(jī)酸含量能起到優(yōu)化木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)組分和改善貯存品質(zhì)的作用，且在長(zhǎng)時(shí)間甲酸作用下，有助于保存可溶性碳水化合物、纖維素、半纖維素和綜纖維素等能量組分。綜合考慮，建議干玉米秸稈與廢棄白菜進(jìn)行混合濕法貯存，且添加適量甲酸的貯存效果最佳。