賈亞利 劉玨 吳黎明 蔡鶯蓮 吳盛海

從人體分離出來的支原體有16種，常見與泌尿生殖道感染有關(guān)的有解脲支原體（Uu）、人型支原體（Mh）、生殖支原體（Mg）等［1］，其中人型支原體是最常見的致病菌之一，其可以引起非淋球菌性尿道炎、宮頸炎，進(jìn)而引發(fā)前列腺炎、腎盂腎炎、女性盆腔炎等，并可能與不孕不育、習(xí)慣性流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等有關(guān)［2-4］。有報(bào)道稱，在男性支原體感染可以影響精子的濃度、活動(dòng)度、形態(tài)，且可能破壞生精細(xì)胞，從而導(dǎo)致男性不育［5］。臨床治療常選用抗生素治療，阿奇霉素是指南推薦的一線用藥，但耐藥率越來越普遍，治療變成一個(gè)棘手的問題，尋找一種有針對(duì)性的藥物成為治療的方向［6］。本實(shí)驗(yàn)比較柴胡皂苷d（Sd）與阿奇霉素對(duì)人型支原體在體外的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料 培養(yǎng)基購自珠海迪爾生物工程有限公司。受試菌株人型支原體來自杭州市第一人民醫(yī)院皮膚科及婦產(chǎn)科的臨床分離株。阿奇霉素針劑，購自東北制藥企業(yè)沈陽第一制藥有限公司。柴胡皂苷d購自中國藥品生物制品研究所。水溶性柴胡皂苷單體d溶于滅菌的雙蒸水，與阿奇霉素針劑均配置成濃度為1280mg/L的備用液，置于-20°冰箱備用，臨用前解凍。

1.2 菌株的準(zhǔn)備 支原體菌懸液制備和接種20株Mh受試菌株自臨床分離傳代后，接種至支原體液體培養(yǎng)基，37℃恒溫箱中 48h，至生長最佳狀態(tài)（CFU＞104）［7］，取100μl接種于預(yù)熱的藥物敏感測試板。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 棋盤微量稀釋法，其能精確測定抗菌藥物在不同濃度時(shí)對(duì)微生物生長的抑制作用。具體方法：阿奇霉素和柴胡皂苷的起始濃度均為256mg/L，并在滅菌管中進(jìn)行10級(jí)倍比稀釋。在96孔（12×8）板的前2排中依次加入倍比稀釋好的不同濃度的阿奇霉素100μl，在第3和第4排中加入不同濃度的柴胡皂苷d各100μl，在所有測試的40個(gè)孔中均加入100μl待測菌液，縱向第11列加200μl待測菌液，不加藥物作為生長對(duì)照，第12列加入200μl液體支原體培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照。

1.4 Sd及阿奇霉素對(duì)Mh作用的結(jié)果判定，接種后的96孔板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，采用視覺終點(diǎn)判定。藥物敏感終點(diǎn)判讀參考M-27中對(duì)微量液體培養(yǎng)基稀釋法的標(biāo)準(zhǔn)，抗生素類藥物以80%抑菌作為觀察終點(diǎn)，判斷最低抑菌濃度（MIC）。柴胡單體的結(jié)果判斷參考抗生素類藥物進(jìn)行。

2 結(jié)果

Sd對(duì)Mh的MIC值在0.25～8mg/L，阿奇霉素對(duì)Mh的MIC值在0.25～64mg/L；采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)算出 t=2.3368，查表知 t0.05（19）=2.093，t0.01（20）=2.861，t0.05（19）＜t＜t0.01（20），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sd 的MIC50為1mg/L，阿奇霉素MIC50為2mg/L。Sd與阿奇霉素在體外對(duì)人型支原體均有抑菌作用。Sd對(duì)Mh的抑菌作用優(yōu)于阿奇霉素。見表1、2。

表1 Sd及阿奇霉素對(duì)20株人型支原體的MIC（mg/L）

表2 Sd與阿奇霉素對(duì)Mh的MIC比例［n（%）］

3 討論

阿奇霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其作為指南推薦的抗支原體一線治療藥物，在臨床使用中，胃腸道的副作用發(fā)生率較高，多數(shù)患者出現(xiàn)惡心、食欲不振等腸胃不適，嚴(yán)重者嘔吐。且在近幾年研究中發(fā)現(xiàn)，其耐藥率比例也較高，導(dǎo)致臨床治療失敗病例逐漸增多，感染病情遷延不愈［1］。阿奇霉素的抗菌作用，通過與細(xì)菌核糖體50s亞基結(jié)合，阻礙細(xì)菌轉(zhuǎn)肽過程，抑制依賴于RNA的蛋白質(zhì)合成從而達(dá)到抗菌作用。支原體對(duì)其耐藥產(chǎn)生機(jī)制主要是生物膜的形成［8］，生物膜增強(qiáng)Mh對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素等多種常用抗生素的抵抗力。

黃崢燁等［9］研究認(rèn)為柴胡皂苷d對(duì)解脲支原體有抑菌作用，發(fā)現(xiàn)50株解脲支原體對(duì)四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星均有不同程度的耐藥，但同時(shí)卻對(duì)Sd顯示敏感，即在體外實(shí)驗(yàn)中，Sd的抗菌活性優(yōu)于這三種抗生素。本實(shí)驗(yàn)中Sd也顯示較強(qiáng)的對(duì)于人型支原體的抗菌活性。陳志寶等研究柴胡皂苷a對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用［10］，采用基因芯片檢測，結(jié)果表明，柴胡皂苷a作用于金黃色葡萄球菌45min后引起相關(guān)基因表達(dá)水平的改變?cè)谒斜O(jiān)測基因中，26個(gè)上調(diào)基因，68個(gè)下調(diào)基因，其中有13個(gè)毒力因子的表達(dá)受到影響，且表達(dá)水平全部下調(diào)，即抑制金黃色葡萄菌的毒力水平；1個(gè)編碼超氧負(fù)離子壓力反應(yīng)蛋白基因vraR和vraS被誘導(dǎo)上調(diào)；還有4個(gè)核黃素合成蛋白ribA，B，H，D被顯著抑制，這幾個(gè)是酶的輔助因子的合成基因，在呼吸代謝途徑起作用，同時(shí)還與超氧負(fù)離子有關(guān)。也可以認(rèn)為柴胡皂苷d的作用機(jī)制，可能在基因水平上降低多糖及某些蛋白質(zhì)的合成從而抑制生物膜的形成。這些均需要進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

新藥的臨床前藥理研究是過渡到臨床的重要橋梁，也是評(píng)價(jià)新藥的關(guān)鍵步驟。一個(gè)新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需要藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)。首先采用體外試驗(yàn)方法，觀察試驗(yàn)物對(duì)病原菌有無殺滅作用或抑制作用。篩選到體外實(shí)驗(yàn)有效的化合物應(yīng)進(jìn)一步確定其分子結(jié)構(gòu)，為深入研究提供數(shù)據(jù)。作者觀察到的柴胡皂苷單體d在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)人型支原體Mh有較好的抑制作用，效果顯著強(qiáng)于阿奇霉素，值得對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，也應(yīng)該測試其對(duì)于常見的球菌、桿菌等致病微生物的體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究，為最終進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)藥理研究打下基礎(chǔ)。