月季黑斑病及其抗性研究進展

張真建 向貴生 陳敏 王其剛 唐開學(xué) 邱顯欽

摘要：月季黑斑病是世界性的病害，發(fā)生普遍且嚴重，較難防治，其病原菌為薔薇盤二孢（Marssonina rosae）。伴隨著月季定向選育工作的開展，其病原菌易產(chǎn)生各類生理小種，導(dǎo)致月季的抗病性逐漸變?nèi)?雖然噴施化學(xué)藥劑的方法可以用來抑制病原菌的產(chǎn)生，但化學(xué)藥劑的大量使用不僅增加了生產(chǎn)成本，還會導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的惡化。本文總結(jié)了月季黑斑病的發(fā)病癥狀、發(fā)病原因、防治方式、抗病性等，旨在為尋找新的抗黑斑病的月季新品種提供理論上的支持，同時為花卉抗病性的相關(guān)研究提供新的思路。

關(guān)鍵詞：月季;黑斑病;防治方式;抗病性;抗性品種

中圖分類號： S436.8+1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0078-07

收稿日期：2018-01-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31560565、31160403）;國家科技支撐計劃（編號：2015BAD10B01）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃（編號：2014FB158）;云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項目（編號：2015HB078）。

作者簡介：張真建（1993—），男，廣西欽州人，碩士研究生，主要從事月季抗病遺傳研究。E-mail：guangxidadad@163.com。

通信作者：唐開學(xué)，博士，研究員，主要從事月季遺傳育種研究，E-mail：kxtang@hotmail.com;邱顯欽，博士，研究員，主要從事月季抗病遺傳育種研究，E-mail：xianqin711@hotmail.com。

月季（Rosa hybrida）系薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，既是世界上的四大鮮切花之一，也是中國的十大傳統(tǒng)名花之一，享有“花中皇后”的美譽[1]。因其花形優(yōu)美、花期較長、繁殖較易、適應(yīng)力強等特點，備受人們的喜愛，中國的許多城市將它作為市花[2]。

月季黑斑病最初的描述可以追溯到Fries（1815）和Libert（1826）的報道中[3-4]，我國安徽省在薔薇屬植物上發(fā)現(xiàn)第一例黑斑病。月季黑斑病廣泛分布于世界各地，發(fā)病嚴重且難以防治，是一種世界性的病害[5-6]。國內(nèi)外對其的相關(guān)研究也從未間斷，但側(cè)重點不同，國外重點研究月季黑斑病的抗病基因[7]，國內(nèi)重點研究的有2個方面：一是將野生型的抗病基因轉(zhuǎn)移到栽培的品種中，以期得到抗病的優(yōu)良品種[8-9];二是綜合治理月季黑斑病，減少不必要的損失[10]。

月季黑斑病極易發(fā)生的季節(jié)是溫暖而潮濕的夏秋兩季，其發(fā)病主要與溫度、濕度密切相關(guān)。發(fā)病初中期的主要特征為月季葉片發(fā)黃、莖部出現(xiàn)黑色斑點、花梗呈現(xiàn)紫色至黑色條斑、花瓣顯現(xiàn)黑色斑點，后期出現(xiàn)葉子全部脫落、植株死亡等一系列的問題，這樣不僅嚴重影響了月季的觀賞價值和商業(yè)價值，還會導(dǎo)致月季產(chǎn)品的進一步推廣和使用受到限制[11-12]。黑斑病除嚴重危害月季栽培品種外，還嚴重危害薔薇屬的其他野生資源，如玫瑰（R. rugosa）、野薔薇（R. multiflora）、金櫻子（R. laevigata）、黃刺玫（R. xanthina）等[13]。

目前，月季是世界上消費量最大的鮮切花之一，但隨著定向選育工作的不斷進行、殺菌劑的不斷使用，以及新的生理小種的不斷產(chǎn)生，栽培月季的基因多樣性逐漸降低，抗病能力進一步減弱[14]。噴灑殺菌劑的高成本及毀壞環(huán)境的高風(fēng)險，使得培育和選育抗性強的新品種成了新的出路[15]。本文從月季黑斑病的發(fā)病癥狀、發(fā)病原因、防治方式以及抗病性展開論述，旨在為月季黑斑病的進一步研究提供切實的理論支撐。

1 月季黑斑病概述

月季黑斑病也稱月季褐斑病，在國內(nèi)外各地區(qū)普遍發(fā)生[16-18]，嚴重影響月季的生長與開花，使其失去綠化美化環(huán)境的作用。

1.1 發(fā)病癥狀及危害

黑斑病為世界性的病害，主要危害月季的葉片，其次危害嫩莖、花梗、花蕾、新梢等部位[19-21]。葉片發(fā)病初期，葉片正面出現(xiàn)不規(guī)則邊緣，第一個明顯癥狀是葉片上側(cè)大約1 mm的黑點[22];發(fā)病中期逐漸擴展為直徑為2～12 mm的不規(guī)則形的、半圓形的或圓形的黑色或深褐色的病斑，病斑周圍有黃色的暈圈包圍，病斑間可以相互融合;發(fā)病后期，葉片上的病原菌分生孢子在病斑部位呈現(xiàn)出皰狀小點，病斑中央的組織則呈現(xiàn)出灰白色，并且病葉逐漸變成黃色至脫落，嚴重時能導(dǎo)致整株葉片脫落，直至植株死亡[23]。嫩莖染病后，病斑呈現(xiàn)出紫色或黑色的條形或長橢圓形的斑點，病斑稍稍下陷;花梗染病后的癥狀和嫩莖染病后的癥狀類似;花蕾染病后，病斑呈現(xiàn)出紫黑色橢圓形斑點;新梢染病后，病斑呈現(xiàn)出紫黑色長橢圓形斑點，病斑稍外凸起[23-24]。月季植株的不同部位都有不同程度的感染，這樣不僅影響了植株的生長，還會導(dǎo)致其開花不正?；蚧ú荒荛_放，進而使其觀賞性大大降低。研究表明，發(fā)生過黑斑病的月季品種，病葉脫落后，再次萌發(fā)的新葉更容易感染月季白粉病。

1.2 黑斑病菌的分類

黑斑病菌是一種生長緩慢的真菌，導(dǎo)致植株感病的病原菌有2種：第一種為薔薇盤二孢（Marssonina rosae），異名稱薔薇放線孢菌（Actinonema rosae）[25]，屬于半知菌類;另一種為鏈格孢菌（Alternaria）[26-29]。致使月季感病的是薔薇盤二孢[30-32]，隸屬于半活體營養(yǎng)型真菌[33]，有性態(tài)為薔薇雙殼菌（Diplocarpon rosae），屬于子囊菌屬;無性態(tài)為薔薇放線孢菌，隸屬于半知菌亞門（Deuteromycotina）腔孢菌綱（Coelo mycetes）黑盤孢目（Melanconiales）放線孢屬（Actinonema）。

1.3 黑斑病菌的形態(tài)

菌絲和分生孢子盤是月季黑斑病菌生長的2種不同的形態(tài)。分生孢子近橢圓形或長卵圓形;無色，雙胞，分隔處略縊縮，2個細胞大小不等，略微彎曲，大小為（17.5～25.2） μm×（5.0～7.5） μm[23，34-35]（圖1-A）。分生孢子盤起初埋生于角質(zhì)層下，后突破表皮，圓形至不規(guī)則形，黑色，直徑為 108～198 μm，盤下有放射狀的菌絲（圖1-B）。菌絲生長于寄主角質(zhì)層與表皮細胞之間，以垂直分枝的形式穿過細胞壁進入細胞，形成吸器吸收營養(yǎng)（圖1-C）。當處于有性態(tài)時，其子囊盤寄生于越冬病葉的表面，球形至盤形，深褐色，裂口呈輻射狀;子囊圓筒形，子囊孢子長橢圓形，含1個隔膜，2個細胞大小不一，其有性態(tài)很少見[34]。

1.4 發(fā)病原因及發(fā)病規(guī)律

1.4.1 發(fā)病原因 為了得到高抗的月季品種，必須先要了解月季黑斑病發(fā)病的原因，目前已知的誘發(fā)月季黑斑病發(fā)病的原因有很多。其一，人們對其外形、花香等的需求使得品種與日增多，多樣的品種也就有了對黑斑病不同的抗性，即品種間不同的抗性[36]。其二，孟志卿等進行了不同月季品種酶活性對抗病性的研究，證實了酶活性與品種抗病性有著密切的聯(lián)系[37]。其三，環(huán)境條件對于孢子萌發(fā)也是至關(guān)重要的因素，丁世民研究發(fā)現(xiàn)悶熱、高濕的夏秋兩季有利于月季黑斑病的發(fā)生[38]。其四，栽培設(shè)施對月季的抗性也有影響，韓淑玲以抗病能力較強的紅衣主教及抗病能力較差的卡爾紅為代表來進行試驗，試驗證實具滴灌設(shè)備的棚內(nèi)栽培比無滴灌設(shè)備（即漫灌）的棚內(nèi)栽培發(fā)病輕[39]。

1.4.2 發(fā)病規(guī)律 溫度及相對濕度對分生孢子的萌發(fā)起著至關(guān)重要的作用，在溫暖潮濕的環(huán)境中，病菌孢子可蔓延孳生[40-41]。越過冬后的分生孢子在相對濕度為23%～99%時可萌發(fā)侵入。黑斑病發(fā)病的最適溫度為17～25 ℃，當溫度超過30 ℃則發(fā)病減少。Drewes-Alvarez研究表明分生孢子在0～33 ℃的情況下都能夠萌發(fā)[42]，Melching研究表明病原菌在6～33 ℃間均可以進行侵染[43]，而Gachomo等認為在 10 ℃ 情況下病害癥狀將不會出現(xiàn)[44]。同樣，相關(guān)研究已證實相對濕度對分生孢子的萌發(fā)也起著至關(guān)重要的作用，Aronescu研究表明需提前將分生孢子放在濕氣環(huán)境中 15 h 才能使月季感病[45]。并且還有一些研究發(fā)現(xiàn)pH值對于分生孢子的萌發(fā)也有著很大的作用，Jenkins等研究表明當pH值為3.6～6.6時，病原菌的生長勢不同;當pH值為4.8～5.4時，病原菌生長最好[46]。月季黑斑病4月中旬開始發(fā)病，發(fā)生的主要月份為7—9月，發(fā)病的首要條件是光照不足、通風(fēng)不良、高溫高濕[47-48]。

1.5 月季黑斑病的致病概述

月季黑斑病菌主要以存在于芽鱗、病葉、病落葉或病枝上的菌絲體或分生孢子盤的形式越冬。菌絲體寄生在寄主角質(zhì)層與表皮細胞之間，侵染時以垂直分枝的形式穿過細胞壁進入細胞，形成吸器吸收營養(yǎng);分生孢子盤起初埋生于角質(zhì)層下，后突破表皮。單學(xué)敏等認為月季黑斑病在某些特定的條件下能夠產(chǎn)生有性世代，但不提供初侵染源[49]，表明月季黑斑病的初侵染源主要是越冬的菌絲體和分生孢子2種形式[50]。不同的栽培方式會導(dǎo)致病原菌越冬部位和方式不同，露地栽培月季上的病原菌以菌絲體的形式在芽鱗、葉痕及枯枝落葉上越冬，菌絲體在翌年5—6月產(chǎn)生分生孢子進行初侵染;保護地栽培月季上的病原菌以菌絲體和分生孢子在發(fā)病部位越冬，并成為初侵染的來源。次年早春，隨著休眠芽的萌發(fā)，展葉，越冬的菌絲體逐漸活躍起來，形成分生孢子盤，隨后產(chǎn)生分生孢子完成初侵染。

分生孢子侵入的部位為葉片的表皮，潛伏期為7～10 d，侵入葉片正面的11 d左右就形成分生孢子盤，侵入葉片背面的得經(jīng)過1個月左右才能形成子實體。條件適宜情況下，分生孢子盤可破裂釋放出新的分生孢子，進行再侵染。因為病菌具有多次重復(fù)侵染的能力，所以在月季生長季節(jié)內(nèi)能夠重復(fù)多次發(fā)病[23，35]。月季黑斑病的傳播方式多樣，一般靠機械力量傳播。分生孢子借雨水、噴灌水飛濺、風(fēng)、昆蟲、操作人員等傳播，病原菌遠播的媒介還包括帶病的苗木、植株及切花[51]。

2 黑斑病的防治方式

植物病蟲害的防治一般采取“以防為主、防重于治”的原則。目前，在生產(chǎn)和育種工作中，主要通過選擇高抗的品種、加強栽培管理、混合種植多品種、藥劑防治、誘導(dǎo)抗性和生物防治來對月季黑斑病進行防治。

2.1 選擇高抗的品種

月季品種間對黑斑病的抗性是不一樣的，選擇種植高抗的月季品種可以從源頭上遏制月季感染黑斑病。1955年，美國科學(xué)家Jenkins首次研究發(fā)現(xiàn)，月季黑斑病各地的病原菌致病力不同，提出月季黑斑病存在地理小種的概念[52]。選擇紅衣主教、大衛(wèi)、薩曼莎、伊麗莎白、黑千層、和平、湯普森、喜洋洋、火烈鳥、貝拉米等[23，51]高抗品種可有效抵御黑斑病的感染。

2.2 加強栽培管理

栽培管理得當，可以減少感病的可能性。栽培過程中，應(yīng)該避免濕冷、悶熱、栽植過密和通風(fēng)不良等容易導(dǎo)致月季感病的環(huán)境條件;施肥時應(yīng)多施磷、鉀肥，少施氮肥[53];澆水采取滴灌、溝灌等方式，并且由于潮濕利于病原菌的侵入，因此應(yīng)避免夜間澆水;松土培土可以提高月季的長勢;Wolf研究發(fā)現(xiàn)病菌越冬的主要部位在落葉上，在菌絲體越冬后以及萌發(fā)前的秋季或早春采用集中燒毀落葉的方式可以減少黑斑病的發(fā)生[54]，因此秋季徹底清除殘枝落葉，冬季修剪病枝、病葉，集中燒毀或深埋，減少侵染源，為月季營造良好的生長環(huán)境。

2.3 混合種植多品種

混合種植，避免單一品種，可以有效遏制病原菌的傳播速度，減少病害的發(fā)生。徐明慧等將抗病性較強的月季品種與嚴重感病的月季品種進行混栽，但前者依然不易感病[17]。也有研究者發(fā)現(xiàn)混栽抗病能力不同的月季，抗病性強的依然強[15-16]。

2.4 藥劑防治

目前，可用來防治月季黑斑病的藥劑種類眾多。種植月季前，可用福美胂藥沙進行土壤消毒，殺滅病原菌[55]。發(fā)病前，即病原菌休眠期，在春季發(fā)芽前對植株和地面噴灑石硫合劑[20]，可以有效地清除越冬菌源。發(fā)病初期，用百菌清可濕性粉劑防治。發(fā)病期間，用甲基托布津可濕性粉劑兌水噴灑，每周1次，噴3～4次。發(fā)病嚴重時，可用百菌清噴灑，7～10 d 噴1次，連噴3～5次。持續(xù)使用同種藥劑容易使病菌產(chǎn)生抗藥性，所以在使用一種藥劑一段時間后，應(yīng)更換其他種藥劑，這樣防治效果更明顯。

2.5 誘導(dǎo)抗性

植物誘導(dǎo)抗性可使植物獲得抗性，增強對病蟲害的抵御能力。Ray等發(fā)現(xiàn)用真菌的弱毒菌株接種秋海棠（Begonia evansiana），能使秋海棠對同一真菌的強致病菌株產(chǎn)生抗性[56]。除此外，水楊酸能夠誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性，金一鋒用不同濃度的外源性水楊酸誘導(dǎo)感病與抗病的月季品種，以此來觀察水楊酸對黑斑病的抑制效果，結(jié)果表明水楊酸濃度低時，對黑斑病菌菌絲的生長起不到干擾，但隨著濃度的升高，黑斑病菌絲的生長受到了明顯的抑制[57]。

2.6 生物防治

近年來生物防治的普遍流行，也給月季黑斑病的生物防治帶來了啟發(fā)。Muthusamy等研究發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲的生長在很大程度上受到熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens pf1）和綠色木霉（Trichoderma viride）的抑制[58]。尋找到能夠抑制黑斑病菌的其他生物將是防治黑斑病的又一出路。

3 月季品種的抗性

不同的月季品種對黑斑病具有不同的抗性，不同地域種植的同一品種也對黑斑病具有不同的抗性[36]。徐明慧對金背大紅、德國白、火焰3種月季品種接種黑斑病病原菌，并觀察它們的發(fā)病率，發(fā)現(xiàn)發(fā)病率差別很大[59]。黃聲儀對800個月季品種的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同品種間抗病性差異明顯，中、高抗居多，中、高感極少數(shù)[60]。李宏斌研究發(fā)現(xiàn)薩蔓莎、紅成功、紅衣主教等紅色系切花品種的抗性較弱，極易感染，而金徽章等黃色系切花品種的抗性較強，不易感染[61]。王永格等對15個月季品種黑斑病的發(fā)病情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，15個月季品種中有1個高抗，1個中抗，2個低抗，6個感病，5個嚴重感病[62]。其他研究發(fā)現(xiàn)小姐妹月季、灌叢月季、原生種月季及藤本月季對黑斑病的抗性較強，而雜交茶香月季、微型月季、豐花月季及壯花月季的抗性較差。這為我們的育種工作提供了參考，因此在引種種植過程中應(yīng)優(yōu)先選擇抗病性能較好的月季品種[10，63]。

目前，野生的月季品種雖具較高的抗病性，但自然界中未發(fā)現(xiàn)有完全抗病的月季品種[64-65]，尋找完全抗病的品種將是之后一段時間研究的重點。

3.1 月季抗黑斑病的超微結(jié)構(gòu)

黑斑病危害月季最嚴重的部位為葉片，吳雪芬等對160多個月季品種調(diào)查了葉片與黑斑病間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉薄有光澤月季與葉厚無光澤月季、葉厚有光澤月季的病情差異顯著[10]。探討月季的超微結(jié)構(gòu)對于黑斑病的防治將有一定作用。病菌進入植物的主要途徑為氣孔，徐東生研究發(fā)現(xiàn)，不同月季品種嫩葉的氣孔密度小于老葉，抗病品種的氣孔密度遠小于感病品種的氣孔密度[66]。黃曉玲等用掃描電鏡和透射電鏡對病原菌侵染葉片后的細胞超微結(jié)構(gòu)進行了觀察，發(fā)現(xiàn)抗病品種的后代葉片表皮有大量菌絲分布，僅少量的菌絲進入氣孔內(nèi)部;而感病品種葉片表皮氣孔下陷，孢子附著在葉片的表面[67]。Reddy等也從葉片的形態(tài)上去尋找與抗黑斑病的相關(guān)特征，發(fā)現(xiàn)孢子較易透過表皮進行繁殖[68]。Walker等認為蠟質(zhì)的存在對月季的抗病也是有很大作用的，因分生孢子萌發(fā)需潮濕的環(huán)境，若蠟質(zhì)存在，可使水滴不殘留于葉片上，減少了發(fā)病的可能[69]。

3.2 黑斑病的生理生化機制

月季感染黑斑病后，各種生理生化水平變化顯著。Kenneth Horst研究發(fā)現(xiàn)月季黑斑病感染葉片后，會在病葉組織中產(chǎn)生乙烯[70]。Suhas等研究發(fā)現(xiàn)葉片在受到黑斑病感染后，病原菌會產(chǎn)生脫落酸，使葉片早早脫落[71]。徐明慧研究發(fā)現(xiàn)月季黑斑病發(fā)病高時，月季的葉綠素和氨基酸含量會下降[72]。孟志卿對月亮花、日暉、洛神、金石竹、茶香葉片的生理生化物質(zhì)進行了測定，抗黑斑病品種的月亮花、日暉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性均比其他感病品種的高;同一品種而言，嫩葉的酶活高于老葉[73]。徐東生對抗黑斑病能力不同的5個月季品種的脯氨酸、SOD、POD及PPO的含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)了老葉的脯氨酸含量高于嫩葉，感病品種的脯氨酸含量會下降，抗病品種的都略有上升;抗病品種嫩葉SOD活性高于感病品種;與老葉相比，病葉SOD、PPO活性上升，POD活性有降有升[66]。不同抗病和感病月季品種在感染黑斑病后，其體內(nèi)的酶含量會表現(xiàn)出不同的上升和下降趨勢，根據(jù)這些酶含量的不同，可清楚地辨別感病情況。

3.3 抗性鑒定

不同的月季品種對黑斑病的抗性是不同的，目前，月季黑斑病抗性鑒定的研究很少。丁世民對月季黑斑病的發(fā)生規(guī)律做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種的切花月季對黑斑病的抗性會有所差異[38]。趙玉霞對山東地界的切花月季的發(fā)病規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，黑斑病的發(fā)生與切花月季品種密切相關(guān)，不同的切花月季具有不同的抗性[74]。馬燕對月季與野生薔薇之間的雜交品種群及其親本采用離體葉片侵染的方法來對其進行抗黑斑病的鑒定，建立抗黑斑病等級模型，根據(jù)綜合值的不同來確定不同品種的抗黑斑病等級[64]。黃曉玲對抗感不同的現(xiàn)代月季雜交后代的抗病性鑒定使用的方法也是離體葉片侵染[67]。王瓊采用離體葉片侵染方法對48個月季品種的抗性等級進行了劃分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有篝火、金瑪麗、洛麗塔、芳純4個高抗的品種[75]。任春光等采用品種田間自然抗性鑒定法對52個月季品種進行抗性鑒定，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)17個高抗黑斑病品種[76]。國外研究報道大衛(wèi)、湯普森、月亮花、金色無暇等月季品種為高抗品種。王永格采用月季抗病品種分級標準[77]鑒定了15個月季品種，僅發(fā)現(xiàn)至高無上1個高抗品種[62]。

3.4 抗性評價

離體鑒定和田間自然抗性鑒定是鑒定月季品種抗黑斑病的方法。植物對某種病原菌的抗性鑒定不單是受單一因素的影響，而是要考慮到諸多因素，例如致病基因、環(huán)境因子、外源物以及病原菌和植物之間的作用等等，采用同種鑒定條件與標準也就成為判斷植物對病原菌的抗病性要求[78]。金一鋒等對9個月季品種的研究發(fā)現(xiàn)，當孢子濃度為2×105個/mL時，可較好地反映出抗黑斑病的能力，該孢子濃度為抗性鑒定的最佳濃度[79]。

3.5 抗性遺傳

植物的抗性是可遺傳的，葛紅等對不同月季品種雜交后代進行篩選，發(fā)現(xiàn)其抗病株率差異較大[80]?？讜硨⒑诎卟】剐詮姷母副竞湍副具M行雜交，將親本基因?qū)牒蟠?，得到了黑斑病抗性強的后代[81]。黃曉玲等則認為父母本對后代的黑斑病抗性強弱都會產(chǎn)生一定的影響[67]

4 月季抗黑斑病的分子水平研究

伴隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的興起，使原本僅從植物表征上尋找抗病品種的抗病育種研究更進一步。月季抗黑斑病的機制研究主要為垂直抗性方面，如Byrne等研究者的染色體加倍[65，82]，Kaufmann的圖位克隆[83]，Yan等研究者的分子標記[84-86]，Whitaker等的雜交及抗病表型分離[87-89]等多種方法，Biber等和von Malek等克隆得到了第一個抗病基因Rdr1[90-91]，Whitaker等克隆得到Rdr3基因[89]，并且發(fā)現(xiàn)了單一的顯性基因控制抗性[91-92]，因此也獲得了少量的抗病材料。

需要獲得可遺傳的抗病月季品種，不僅需要停留以篩選出花型、花色、花香等外在特征的階段，還應(yīng)該注重其內(nèi)在特征，如抗旱、抗寒、抗病等。雜交育種、突變育種[93]等常規(guī)育種方法將獲得的基因或想要獲得的基因添加到月季中去，并且近年來像基因工程、分子標記等非常規(guī)的技術(shù)也逐漸被應(yīng)用到育種工作中[94-96]。

4.1 抗病基因的研究

不同月季品種間的抗黑斑病能力表現(xiàn)各有差異，因此可判定月季的抗病基因表達水平存在著一定的差異性。1971年Flor提出了“植物對某種病原物的特異抗性取決于它是否具有相應(yīng)的抗性基因”的基因?qū)虻目共⌒詫W(xué)說[97]，隨后國內(nèi)外的研究者們對抗性基因進行了一系列的研究。先前的研究發(fā)現(xiàn)抗病基因誘導(dǎo)的后期防御的基因如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖苷酶和PR蛋白基因?qū)胫参锸怪^量表達，可以使植物獲得抗性[98]。Ballard等利用RFLP和RAPD技術(shù)對22個月季品種進行抗黑斑病能力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同倍數(shù)月季品種抗黑斑病能力不同，其中二倍體的月季抗性較強[7]。von Malek等將RFLP探針定位到月季染色體圖譜上，發(fā)現(xiàn)了第一個抗黑斑病基因Rdr1，隨后利用7個AFLP分子標記，將Rdr1基因定位到1.1～7.6 cM圖距之間[99]。Debener等將二倍體月季進行雜交，然后利用分子標記篩選到了28種對黑斑病有高抗性的基因型，還繪制出了染色體上Rdrl基因周圍的基因排列情況[100-101]。劉瑞峰等以粉和平葉片為試材，對其接種黑斑病菌來研究月季響應(yīng)黑斑病的差異表達基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)響應(yīng)黑斑病的基因很多，病原菌侵染植物后能引起一系列的連鎖反應(yīng)[11]。

4.2 月季遺傳圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜包括經(jīng)典遺傳圖譜、分子遺傳圖譜、同工酶遺傳圖譜3種[102]。用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的遺傳標記主要包括形態(tài)學(xué)標記、細胞學(xué)標記、生物化學(xué)標記和DNA分子標記4種。遺傳圖譜的優(yōu)越性在于可為性狀定位、功能基因克隆、分子標記輔助選擇育種等提供技術(shù)平臺。

Debener等采用Grattapaglia提出的“雙擬測交”策略獲得了二倍體野薔薇雜交的F1代，利用305個RAPD和AFLP分子標記對其進行了研究，建立了第一張二倍體月季遺傳圖譜，利用分子標記研究二倍體月季的抗性基因遺傳及基因圖譜構(gòu)建，在此基礎(chǔ)上，標記定位了黑斑病抗性基因Rdr1[103-105]。Crespel等利用AFLP分子標記對二倍體光葉薔薇（R. wichuraiana）和單倍體現(xiàn)代月季品種雜交F1代為材料進行了研究，結(jié)果顯示68和108個標記位點分別位于母本的8個和父本的6個連鎖群中，建立了另一套二倍體月季遺傳圖譜，并對月季中控制花刺數(shù)量、連續(xù)開花及復(fù)花冠的基因進行了定位[106]。Dugo等以粉紅努塞特和光葉薔薇雜交的96株F1代為材料，作了133個標記，其中130個RAPD，1個形態(tài)學(xué)標記，2個微衛(wèi)星標記，結(jié)果得出總共14個連鎖群[107]。Linde等于2006年對二倍體月季的雜交F1代，利用AFLPs，RGAs和其他標記類型構(gòu)建二倍體種群的綜合連鎖圖，分別對父母本構(gòu)建了7個連鎖群[108]。

周青以古老月季品種月月粉（R. chinensis Pallida）和園藝品種光葉薔薇雜交得到F1代164株為材料，結(jié)合SSR標記及雙擬測交策略構(gòu)建了二倍體月季遺傳圖譜[109]。除二倍體的遺傳圖譜外，還建立了四倍體的遺傳圖譜。相比較于這2種遺傳圖譜，二倍體遺傳圖譜進行性狀定位時，往往效率低下，加之目前較多的月季品種為四倍體，因此難以很好地進行品種改良。Rajapakse等以月季沒有刺的莖和葉柄，采用了AFLP、SSR等標記手段來構(gòu)建了2張四倍體月季遺傳連鎖圖，定位了蘋果酸脫氫酶基因和多刺基因位點[110]。Zhang等結(jié)合Rajapakse建立的2張四倍體月季遺傳圖譜，采用二倍體光葉薔薇插入基因組文庫，對含有SSR的序列進行分離，并通過幾個SSR探針進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)設(shè)計的SSR引物對中，多態(tài)性比例為57%，為之后整合二倍體和四倍體月季遺傳圖譜提供了工具[111]。于超以四倍體的古老月季品種云蒸霞蔚及現(xiàn)代月季品種太陽城作為親本，雜交后選擇F1代189株做遺傳圖譜分析，構(gòu)建了迄今為止密度最高的月季四倍體遺傳連鎖圖譜，并應(yīng)用于數(shù)量性狀的基因定位[112]。月季遺傳圖譜的建立為月季抗病品種的選育提供了新的方向，基于遺傳圖譜來定位黑斑病抗病基因，再對抗病基因進行深入研究及利用。

4.3 分子標記輔助選擇育種

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的日益發(fā)展，分子標記輔助選擇育種的研究也得以日益深入[113]。目前常用的分子標記輔助選擇育種方法有RFLP、AFLP、RAPD和SSR等。相比較于傳統(tǒng)育種的時間長、育種效率低下、盲目性和不可預(yù)測性等缺點，分子標記輔助選擇育種具有以下優(yōu)點：（1）在植物生長發(fā)育的任何階段進行選擇，目標性狀的選擇不受基因表達影響;（2）區(qū)分純合體和雜合體可用共顯性標記;（3）表型鑒定困難的性狀可用基因型鑒定，如植物抗病性、抗逆性和根部性狀等;（4）聚合多個有利基因提高育種效率;（5）識別不良性狀連鎖，有利于導(dǎo)入遠源的優(yōu)良基因[114]。馮慧發(fā)現(xiàn)2n配子具有雜種和多倍體的雙重優(yōu)勢，提倡應(yīng)有效利用我國豐富的野生種質(zhì)資源進行種質(zhì)創(chuàng)新和育種[115]。

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