張梓豪 李明 鄭揚(yáng)波 吳燕燕

摘要：通過(guò)在白木香細(xì)胞液體培養(yǎng)基中添加外源硝酸銅[Cu（NO3）2]與其共培養(yǎng)的方法，檢測(cè)白木香細(xì)胞的生長(zhǎng)情況、細(xì)胞活力、銅離子（Cu2+）含量、丙二醛 （MDA） 含量、過(guò)氧化氫 （H2O2） 含量以及超氧化物歧化酶 （SOD）、過(guò)氧化氫酶 （CAT） 和過(guò)氧化物酶 （POD） 活性。結(jié)果表明，在50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香共培養(yǎng)24 h，白木香的細(xì)胞活力較對(duì)照呈顯著下降，隨處理濃度的增加而顯著降低。培養(yǎng)至72 h，隨著Cu（NO3）2濃度的增加，其細(xì)胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均較對(duì)照呈顯著降低的變化。在檢測(cè)的時(shí)間內(nèi)，Cu（NO3）2處理組白木香細(xì)胞的Cu2+含量、H2O2含量、MDA含量均較對(duì)照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高，Cu（NO3）2處理組細(xì)胞的SOD、CAT、POD活性均隨Cu（NO3）2濃度的增加而較對(duì)照顯著升高?？梢钥闯?，一定濃度的外源硝酸銅能夠抑制白木香細(xì)胞生長(zhǎng)和降低其活力，并導(dǎo)致白木香細(xì)胞發(fā)生氧化脅迫。

關(guān)鍵詞：硝酸銅;白木香細(xì)胞;細(xì)胞活力;抗氧化酶

中圖分類(lèi)號(hào)：S718.43? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）05-0106-04

收稿日期：2018-07-03

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃（編號(hào)：2013B020503066、2014A020208133、2016A020226050）。

作者簡(jiǎn)介：張梓豪（1993—），男，廣東佛山人，碩士研究生，主要從事中藥資源與質(zhì)量研究。E-mail：1092292441@qq.com。

通信作者：李 明，博士，教授，主要從事中藥資源及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail：13539843803@163.com。

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]是瑞香科植物，其木質(zhì)部在受到外界環(huán)境脅迫（機(jī)械損傷、化學(xué)刺激、病蟲(chóng)害侵染等）后會(huì)產(chǎn)生和積累次生產(chǎn)物，即結(jié)香[1]。白木香結(jié)香是其在受到環(huán)境脅迫的條件下，體內(nèi)的自我防御的生理生化響應(yīng)過(guò)程。近年來(lái)，張爭(zhēng)等提出了“白木香防御反應(yīng)結(jié)香假說(shuō)”[2]，認(rèn)為物理?yè)p傷，化學(xué)、真菌誘導(dǎo)子侵染等外界刺激能夠誘導(dǎo)白木香發(fā)生防御反應(yīng)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生次生產(chǎn)物的積累。

銅是一種高等植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必需的重要微量營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)及產(chǎn)量等有重要影響，對(duì)于藥用植物的次生產(chǎn)物積累也有一定的影響[3]。研究表明，在一定濃度的銅刺激植物后，植物體內(nèi)的活性氧（ROS）得到積累，并激發(fā)了細(xì)胞的自身防御系統(tǒng)清除過(guò)量積累的ROS，表現(xiàn)出抗氧化酶活性的升高，而過(guò)高濃度的銅能夠使植物體內(nèi)的活性氧大量積累，并且超出細(xì)胞自身的抵御能力，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴(yán)重的破壞，造成抗氧化酶系統(tǒng)嚴(yán)重失衡。

本試驗(yàn)研究了外源銅離子對(duì)白木香細(xì)胞的生長(zhǎng)、活力及抗氧化酶活性的影響，為研究銅離子對(duì)白木香細(xì)胞的影響，以及今后可能在白木香結(jié)香中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 白木香細(xì)胞的培養(yǎng) 參考董閃等的方法[4]，培育白木香愈傷組織。挑取培養(yǎng)14 d的愈傷組織，接種至40 mL的1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L液體培養(yǎng)基中，置于（25±1） ℃的恒溫?fù)u床上，在光照時(shí)間為12 h/d、轉(zhuǎn)速為130 r/min的條件下培養(yǎng)。本試驗(yàn)在廣東藥科大學(xué)（23°20′N(xiāo)，113°30′E;年降雨量為1 623.6～1 899.8 mm;海拔為18 m;溫度為24～32 ℃）中藥樓進(jìn)行。

1.1.2 硝酸銅處理 將過(guò)濾0.45 μm濾膜的不同濃度硝酸銅溶液加入到白木香細(xì)胞培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，定期每天09：00取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 細(xì)胞鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的測(cè)定 參照孫盈盈的試驗(yàn)方法[5]略加修改。每24 h取出經(jīng)硝酸銅溶液處理的白木香細(xì)胞，采用稱(chēng)質(zhì)量法測(cè)定細(xì)胞的鮮質(zhì)量;置于80 ℃烘箱烘約 12 h 至恒質(zhì)量，稱(chēng)量細(xì)胞干質(zhì)量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 參考Mikula等的方法[6]，采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法分別進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)銅離子（Cu2+）含量測(cè)定 參考《中國(guó)藥典》2015版[1]，采用硝酸-高氯酸（4 ∶ 1）法進(jìn)行消解。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量測(cè)定 提取液制備和含量測(cè)定參照李合生的方法[7]，并略作改進(jìn)。

1.2.5 過(guò)氧化氫（H2O2）含量測(cè)定 提取液制備和含量的測(cè)定參照饒力群等的方法[8-9]，并略作改進(jìn)。

1.2.6 過(guò)氧化物酶液制備及其活性測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）酶液的制備和活性測(cè)定參照張志良等的方法[10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，白木香細(xì)胞在與不同濃度的銅離子共培養(yǎng) 72 h 起，隨著Cu（NO3）2濃度的增加，其細(xì)胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均較對(duì)照呈顯著降低的變化（P<0.05）。培養(yǎng)至96 h時(shí)，50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2處理的白木香細(xì)胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別較對(duì)照降低了22.97%、42.42%、49.98%和1365%、2642%、33.17%（圖1、圖2）。

2.2 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞活力的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香共培養(yǎng)24 h后，白木香的細(xì)胞活力隨Cu（NO3）2濃度的增加呈顯著降低的變化（P<0.05）。培養(yǎng)72 h時(shí)，50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2 處理的細(xì)胞活力較對(duì)照組分別降低了72.98%、8586%、9166%（圖3）。

2.3 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞Cu2+含量的影響

由表1可見(jiàn)，用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細(xì)胞共培養(yǎng)，在檢測(cè)的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞的Cu2+含量均較對(duì)照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。在培養(yǎng)72 h時(shí)細(xì)胞Cu2+含量分別較對(duì)照組升高了9.78%、54.29%和60690%（P<0.05）。

2.4 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞MDA含量的影響

由圖4可知，用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細(xì)胞共培養(yǎng)，在檢測(cè)6～72 h，細(xì)胞的MDA含量均較對(duì)照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。在培養(yǎng)72 h時(shí)細(xì)胞MDA含量分別較對(duì)照組升高了65.98%、118.89%、181.69%

2.5 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞過(guò)氧化氫含量的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細(xì)胞共培養(yǎng)，在檢測(cè)的12-72 h，白木香細(xì)胞的H2O2含量均較對(duì)照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。在培養(yǎng)72 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)H2O2含量分別較對(duì)照組升高了33.59%、56.84%、 7569%（P<0.05）（圖5）。

2.6 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞SOD活性的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細(xì)胞共培養(yǎng)，在培養(yǎng)6～72 h時(shí)，細(xì)胞的SOD活性均隨Cu（NO3）2濃度的增加而較對(duì)照顯著升高。在培養(yǎng)24 h時(shí)，各處理的細(xì)胞SOD活性最強(qiáng)，50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2處理的細(xì)胞SOD活性分別比對(duì)照升高了171.16%、187.74%、260.30% （P<005），隨后各濃度的處理均呈降低的變化，但均顯著高于對(duì)照（圖6）。

2.7 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞CAT活性的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細(xì)胞共培養(yǎng)，在檢測(cè)的6～72 h，細(xì)胞的CAT活性均較對(duì)照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高，在培養(yǎng)24 h時(shí)，CAT活性達(dá)到最高，分別較對(duì)照升高了22.37%、83.00%、96.33% （P<005），隨后各濃度的處理均呈降低的變化，但均顯著高于對(duì)照（圖7）。

2.8 Cu（NO3）2對(duì)白木香細(xì)胞POD活性的影響

50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細(xì)胞共培養(yǎng) 6～72 h，細(xì)胞的POD活性均較對(duì)照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。各處理在培養(yǎng)48 h時(shí)，POD活性達(dá)到最高值，分別比對(duì)照升高了131.76%、182.46%、202.54%（P<005），隨后呈降低的變化，但均顯著高于對(duì)照（圖8）。

3 討論

銅離子不僅是許多酶（包括參與呼吸的細(xì)胞色素C氧化酶、參與活性氧清除以及引起酚類(lèi)物質(zhì)氧化褐變、促進(jìn)次生代謝、產(chǎn)生防御反應(yīng)的多酚氧化酶等）的輔基[11-12]，而且是植物體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育所需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，植物如缺乏銅離子會(huì)導(dǎo)致其葉綠素的缺失、光合作用受阻[8]、根系活力的下降[13]等。但外源如土壤中的銅離子過(guò)量則會(huì)脅迫植物產(chǎn)生活性氧，并且會(huì)打破其清除機(jī)制的動(dòng)態(tài)平衡，造成氧化傷害[14]。廖建良等研究表明，銅離子濃度超過(guò)10 mg/L時(shí)，金針菇的生長(zhǎng)受到抑制，且部分細(xì)胞的有絲分裂出現(xiàn)異常[15]。王蕊等對(duì)豌豆苗的研究發(fā)現(xiàn)，100mg/L銅離子會(huì)抑制其幼苗根生長(zhǎng)、芽長(zhǎng)的伸長(zhǎng)，且導(dǎo)致其體內(nèi)SOD、POD、CAT等活性的下降，MDA含量升高[16]。

本研究表明，在不同銅離子濃度脅迫下，白木香懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的影響。在培養(yǎng)24 h時(shí)，細(xì)胞活力呈現(xiàn)明顯下降，處理組細(xì)胞活力較對(duì)照組降幅都達(dá)50%以上，且其細(xì)胞活力隨處理時(shí)間的增加而下降，在同一處理時(shí)間，細(xì)胞活力隨外源銅離子濃度增加顯著降低。細(xì)胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量在培養(yǎng)48 h時(shí)，隨處理濃度的增加在一定范圍內(nèi)顯著下降，在培養(yǎng)72 h時(shí)，下降幅度最大。

藥用植物體內(nèi)銅離子濃度標(biāo)準(zhǔn)不能超過(guò)20 mg/kg[17]。本研究表明，細(xì)胞內(nèi)銅離子含量隨著外源銅離子濃度增加而升高，在硝酸銅誘導(dǎo)細(xì)胞的12 h時(shí)，檢測(cè)到50、100 μmol/L濃度處理組的細(xì)胞內(nèi)銅含量分別為9.45、1549 mg/kg，在高銅脅迫72 h下的白木香懸浮細(xì)胞內(nèi)的銅離子含量顯著增加，較對(duì)照組升高了606.90%，說(shuō)明外源銅濃度的增加與細(xì)胞內(nèi)銅離子含量的增加呈正相關(guān)。

H2O2是一種廣泛存在于植物體內(nèi)各種代謝途徑中的活性氧，同時(shí)也是植物體內(nèi)普遍存在的一類(lèi)重要的防御氧化反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)分子[18-19]。MDA是用于表達(dá)膜質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)，其值越高，表示膜質(zhì)過(guò)氧化程度越高，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重[20]。通過(guò)對(duì)白木香細(xì)胞中MDA含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子濃度的升高，白木香懸浮細(xì)胞內(nèi)的MDA含量、H2O2含量也顯著升高，推測(cè)白木香細(xì)胞在脅迫下，細(xì)胞膜脂發(fā)生了氧化脅迫反應(yīng)。植物自身體內(nèi)具有清除活性氧的體系，主要由SOD、CAT、POD等酶組成。SOD是抗氧化防御中的一個(gè)關(guān)鍵酶，用于清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基（ O-2 ·? ），降低在脅迫作用下細(xì)胞膜受到的損害。CAT、POD 2種酶具有類(lèi)似的功能，主要是清除體內(nèi)過(guò)量的H2O2活性氧，降低ROS（活性氧）的濃度[21-23]。本研究顯示，白木香細(xì)胞在50、100、200 μmol/L濃度的外源銅離子脅迫下，其體內(nèi)POD、SOD、CAT活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降的變化趨勢(shì)，且在同一檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，其活性均隨著硝酸銅濃度的升高而升高，其中，在誘導(dǎo)的24 h時(shí)，CAT、SOD活性達(dá)到最高值，在48 h時(shí)，SOD、CAT活性出現(xiàn)下降的情況，表明細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)可能受到破壞，2種酶的作用下降，無(wú)法清除體內(nèi)過(guò)量的ROS。POD活性隨濃度的升高而升高，至48 h時(shí)達(dá)到高峰，隨后下降。這些結(jié)果與已報(bào)道的部分研究結(jié)果相似[24-25]。

本研究表明，在較高濃度的外源銅離子影響下，白木香細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生氧化脅迫反應(yīng)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，細(xì)胞H2O2含量增加，MDA含量升高，細(xì)胞抗氧化酶活性升高。外源銅離子作為一種誘導(dǎo)子，可誘導(dǎo)白木香細(xì)胞抗氧化酶活性等指標(biāo)產(chǎn)生變化，在細(xì)胞體內(nèi)銅離子濃度最低標(biāo)準(zhǔn)前提下，如何利用外源銅離子誘導(dǎo)白木香細(xì)胞次生產(chǎn)物和有效成分的產(chǎn)生和積累，有待進(jìn)一步的研究。

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