朱文旭，張宏葉，王 濤，王 丹，張紅燕，尹紹武，陳樹橋，周國(guó)勤

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023；2.南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036）

魚類既是自然界重要的生物資源，也是人類主要食物蛋白來源之一。魚類的生長(zhǎng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜而又系統(tǒng)的過程，受到多種激素的調(diào)節(jié)，其中生長(zhǎng)激素和類胰島素生長(zhǎng)因子軸（GHR/IGF軸）作為控制機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝的重要組件發(fā)揮著不可替代的作用。GHR/IGF軸由生長(zhǎng)激素（GH）、生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白（GHBP）、生長(zhǎng)激素受體（GHR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（IGFR）以及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBP）等基因組成［1］。

GH是一種由腦垂體釋放的激素，能夠促進(jìn)魚體生長(zhǎng)，參與多種合成與代謝過程，其在組織和細(xì)胞水平上發(fā)揮作用的前提是與靶細(xì)胞膜上的GHR結(jié)合以介導(dǎo)下游的一系列反應(yīng)。組織中GHR數(shù)量的多少、功能的正常與否將直接影響到GH在組織中效應(yīng)的發(fā)揮［2］。LEE等［3］首次在金魚（Carassius auratus）中克隆出硬骨魚類的GHR基因，迄今為止已有數(shù)十種魚類的 GHR cDNA序列被克隆，包括大菱鲆（Scophthalmus maximus）［4］、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）［5］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［6］等。這些序列與哺乳動(dòng)物的GHR序列具有一定的相似性，說明GHR基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有一定的保守性。VINCENT等［7］對(duì) GHR基因的結(jié)構(gòu)分析表明，GHR兩個(gè)保守的BOX盒序列中任何一個(gè)氨基酸突變都會(huì)導(dǎo)致GH的效應(yīng)喪失，表明它們?cè)贕HR介導(dǎo)的GH生理信號(hào)的過程中發(fā)揮了重要作用。ZHONG等［8］在鯽（Carassius auratus）的研究中表明，禁食處理后，三倍體鯽GHR/IGF軸基因表達(dá)量仍顯著高于二倍體鯽，表明三倍體中GH/IGF軸基因的表達(dá)升高在三倍體魚生長(zhǎng)速度快中起關(guān)鍵作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factors，IGFs）是生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）發(fā)揮作用的介質(zhì)［9］，主要在肝中合成，具有促進(jìn)有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)等作用［10］。IGF家族包括 IGF配體、IGF受體（insulin-like growth factor receptor，IGFR）和6種 IGF結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding protein，IGFBPs）［11］。1978年 RINDERKNECHT等［12］首次在人類血液中分離出IGF-2，此后，IGF-2基因相繼在哺乳類、鳥類、兩棲類等動(dòng)物中被克隆。在 魚 類 中 已 在 虹 鱒［13-14］、大 麻 哈 魚（Oncorhynchus keta）、銀大麻哈魚（O.kisutch）、斑馬魚（Brachydanio rerio）等［12］中克隆得到 IGF-2的cDNA序列。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同魚中的存在形式也不一致。有研究顯示，從羅非魚及馬蘇大麻哈魚（Oncorhynchusmasou）分別檢測(cè)到3種IGF-2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和1種主要的IGF-2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物［15-16］，對(duì)這些不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析表明，它們很可能是由于不同的剪接方式以及具有多個(gè)多聚腺苷酸位點(diǎn)引起的。此外，CHEN等［17］通過對(duì)尼羅羅非魚注射IGF-2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其體質(zhì)量增加了72%，說明IGF-2能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)。

動(dòng)物的生長(zhǎng)軸基因是調(diào)節(jié)出生后生長(zhǎng)的主要內(nèi)分泌軸線，其表達(dá)存在雌雄二態(tài)性，這可能是導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)和形態(tài)變化雌雄二態(tài)性的主要原因。河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）屬鱸形目（Perciformes），沙塘鱧科（Odontobutidae），沙塘鱧屬，在生長(zhǎng)上表現(xiàn)出顯著的性別二態(tài)性，雄性河川沙塘鱧比同期雌性生長(zhǎng)速度快30%以上。目前，關(guān)于河川沙塘鱧生長(zhǎng)調(diào)控分子的研究非常有限，這在很大程度上阻礙了河川沙塘鱧的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本研究首次克隆得到河川沙塘鱧GHR/IGF軸基因GHR和IGF-2的全長(zhǎng)，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)其組織分布及胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)進(jìn)行了分析，并研究了河川沙塘鱧在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織雌、雄魚的生長(zhǎng)差異及GHR、IGF-2基因表達(dá)差異，旨在從分子水平探討河川沙塘鱧生長(zhǎng)相關(guān)基因?qū)ζ渖L(zhǎng)發(fā)育及雌雄生長(zhǎng)差異的調(diào)控機(jī)理，為該魚的高效養(yǎng)殖積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚河川沙塘鱧取自江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所周崗基地，為同一繁殖批次。于玻璃循環(huán)缸中暫養(yǎng)7 d，確定健康無病后開始實(shí)驗(yàn)。采用鏡檢觀察的方法確定胚胎發(fā)育時(shí)期并采集8個(gè)發(fā)育階段（受精卵期、桑椹胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、體節(jié)期、口裂期、出膜后1 d、3 d）。另取1齡河川沙塘鱧［體質(zhì)量（30.0±1.5）g］的9個(gè)組織（腦、肝、鰓、肌肉、腎、性腺、脾、心、腸）的材料用于組織表達(dá)的研究。雌、雄魚基因表達(dá)差異研究則同一繁育批次成魚分別取90、150、210、270、330 d雌、雄河川沙塘鱧，雌、雄魚每時(shí)間段各隨機(jī)取3尾個(gè)體的肝、肌肉、腦組織分裝于1.5 mL離心管中（RNase-free）。所取的全部材料速凍于液氮10 min后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

將-80℃凍存的組織取出，用高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）（Bioteke，Beijing，China）根據(jù)說明書提取河川沙塘鱧組織總RNA，用RNA濃度測(cè)定儀測(cè)定每個(gè)樣品的RNA濃度及純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。以總RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme，Shanghai，China）的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。

1.3 河川沙塘鱧GHR和IGF-2基因全長(zhǎng)的克隆

從河川沙塘鱧轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的cDNA文庫(kù)分別篩選得到654、1 950 bp的IGF-2和GHR基因的cDNA中間 EST序列，5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒獲得基因的 5′端序列。采用 Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得目的基因的3′端序列。本實(shí)驗(yàn)克隆基因所需引物見表1。

1.4 GHR和IGF-2基因的生物信息學(xué)分析

使用DNAman軟件分析基因的生物信息。核苷酸和氨基酸序列的同源性使用BLAST程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行檢索。采用蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)（expert protein analysis system，ExPASy）（http：//www.expasy.org/）確定其開放閱讀框進(jìn)而預(yù)測(cè)氨基酸序列，理論分子量（MW）和等電點(diǎn)（pI）用pI/MW在線工具（http：//www.expasy.org/tools/pi＿tool.html）進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用在線軟件 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)預(yù)測(cè)到的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析，SignalP 3.0（http：//genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，使用在線軟件ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行多序列比對(duì)。用MEGA 5.0軟件（http：//www.megasoftware.net/），重復(fù)1000次構(gòu)建 N-J系統(tǒng)發(fā)育樹［18］。

1.5 河川沙塘鱧GHR和IGF-2基因的表達(dá)分析

根據(jù)已獲得的GHR、IGF-2基因cDNA全長(zhǎng)序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，按照qRT-PCR試劑盒SYBR Green Master kit（Roche， Basel，Switzerland）說明書以β-actin作為內(nèi)參基因分析GHR、IGF-2基因的mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系為20 uL，F(xiàn)aststart Universal SYBR GreenMaster 10μL，正反向引物各3μL，cDNA模板4μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，4℃保存。其中，每條引物配置成濃度為2μmol·L-1的 工 作 液，cDNA 模 板 濃 度 為5 ng·L-1。

表1 克隆GHR和IGF2基因及實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for charactering IGF-2 and GHR gene of Odontobutis potamophila

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法來計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用SPSS 19軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、差異顯著性檢驗(yàn)分析。用t檢驗(yàn)計(jì)算P值，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示。使用Origin 8.6軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHR和IGF-2基因的序列分析

利用RACE技術(shù)克隆得到河川沙塘鱧GHR基因的cDNA全長(zhǎng)序列為2 719 bp（GenBank登錄號(hào)：MG820031）（圖1），包括編碼609個(gè)氨基酸的開放閱讀框1 830 bp、251 bp的5′UTR區(qū)和638 bp的3′UTR區(qū)，其中3′UTR區(qū)域具有28 bp的PolyA尾巴，表明獲得的該cDNA全長(zhǎng)序列3′末端序列具有完整性。ExPASy軟件預(yù)測(cè)的氨基酸分子量為98 589.94，理論等電點(diǎn)為4.8，GHR多肽序列包含一個(gè)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、227個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域、22個(gè)氨基酸的單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和339個(gè)氨基酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，在胞外結(jié)構(gòu)中包含有保守的半胱氨酸殘基和FGDFSmotif，胞內(nèi)有兩個(gè)保守的box（圖1-A）。

IGF-2基因的cDNA全長(zhǎng)序列為1 586 bp（GenBank登錄號(hào)：MG820032）（圖 2），包括 642 bp的開放閱讀框、48 bp的5′UTR區(qū)和896 bp的3′UTR區(qū)，其中3′UTR區(qū)域具有16 bp的 PolyA尾巴，表明獲得的該cDNA全長(zhǎng)序列3′末端序列也具有完整性。共編碼213個(gè)氨基酸，ExPASy軟件預(yù)測(cè)的氨基酸分子量為24 448.46，理論等電點(diǎn)為10.0。IGF-2編碼區(qū)經(jīng)SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)，其包含一個(gè)52個(gè)氨基酸的信號(hào)肽及A、B、C、D和E 5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，且6個(gè)半胱氨酸殘基參與形成3對(duì)二硫鍵（圖1-B）。

2.2 GHR和IGF-2基因的進(jìn)化樹及氨基酸同源性分析

采用MEGA 5.0以N-J法構(gòu)建基于GHR和IGF-2氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。進(jìn)化樹聚類結(jié)果顯示，所有魚類聚為一支，兩棲類（及雞）和哺乳類動(dòng)物聚類為另外的分支，而河川沙塘鱧IGF-2、GHR基因與其親緣關(guān)系較近的大黃 魚 （Larimichthys crocea）、大 彈 涂 魚（Bolephthalmus pectinirostris）等魚類聚為一支，這與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)是一致的（圖2）。同源性序列分析表明河川沙塘鱧GHR基因與大彈涂魚、石斑魚（Epinephelus coioides）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、大黃魚的同源性為68.95%～80.79%（圖 3）。IGF-2基因與大黃魚、尖吻鱸（Lates niloticus）、鱖 （Siniperca chualsi）、卵 形 鯧 鲹（Trachinotus ovatus）的同源性較高，為86.98%～88.84%（圖4）。

2.3 河川沙塘鱧GHR和IGF-2基因的表達(dá)特征分析

利用qRT-PCR的方法分析了河川沙塘鱧GHR、IGF-2基因在9種組織表達(dá)情況，由圖5可知，GHR和IGF-2在9種組織中均有表達(dá)且在肝中的表達(dá)量最高（P＜0.05）；除肝臟之外，GHR在腦、肌肉、性腺和心臟中的表達(dá)量均顯著高于其他4種組織；而IGF-2在肌肉中的表達(dá)量相對(duì)較高，在性腺和腦中的表達(dá)量其次，在其他組織的表達(dá)量相對(duì)較低（圖5）。

分析河川沙塘鱧GHR、IGF-2基因在胚胎到仔魚不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，由圖6可知，GHR基因在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在原腸胚時(shí)期達(dá)到最大值，極顯著的高于其他發(fā)育階段（P＜0.01）。仔魚階段表達(dá)量迅速升高，其表達(dá)量是受精卵階段的4倍。相較于GHR基因，IGF-2在胚胎及仔魚時(shí)期表達(dá)量一直呈升高趨勢(shì)，與GHR基因相似，IGF-2基因在胚胎時(shí)期同樣在原腸胚時(shí)期表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期（P＜0.05）。

2.4 GHR、IGF-2基因的雌雄表達(dá)差異

如圖7所示，雄魚GHR和IGF-2基因在肝中的表達(dá)量顯著高于雌魚，GHR基因表達(dá)呈上升趨勢(shì)，IGF-2則先下降再上升。而在腦和肌肉中僅IGF-2基因在210 d的腦和150、210 d的肌肉中具有顯著性雌雄差異，其他時(shí)期無顯著性差異。

3 討論

魚類的生長(zhǎng)與哺乳動(dòng)物相類似，受到GHR/IGF軸的調(diào)控。GH主要在垂體產(chǎn)生，一方面可與肝臟等靶器官GHR作用，產(chǎn)生IGFs，通過IGFs調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育；另一方面可直接與肌肉等靶器官上GHR結(jié)合，通過JAKSTAT途徑啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)直接影響細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分泌及代謝［3］。本研究首次克隆了河川沙塘鱧IGF-2和GHR基因的全長(zhǎng)序列，序列分析表明河川沙塘鱧IGF-2和GHR基因的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的相應(yīng)基因表現(xiàn)出高度的同一性和相似性，表明這些基因在魚類和哺乳動(dòng)物中可能具有相似的功能。

圖1 河川沙塘鱧GHR（A）和IGF-2（B）cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced am ino acid sequences of O.potamophila GHR（A）and IGF-2（B）cDNA

圖2 河川沙塘鱧與其他物種的GHR和IGF-2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of GHR and IGF-2 gene of O.potamophila and other vertebrates

圖3 河川沙塘鱧GHR氨基酸序列與其他物種同源序列對(duì)比Fig.3 M ultiple alignment of O.potamophila GHR polypeptide sequences w ith other known orthologs

圖4 河川沙塘鱧IGF-2氨基酸序列與其他物種同源序列對(duì)比Fig.4 Multiple alignment of O.potamophila IGF-2 polypeptide sequences w ith other known orthologs

圖5 GHR和IGF-2在河川沙塘鱧不同組織中的表達(dá)Fig.5 GHR and IGF-2 gene expressions in various tissues of O.potamophila

圖6 GHR和IGF-2在河川沙塘鱧胚胎和仔魚發(fā)育過程中的表達(dá)Fig.6 GHR and IGF-2 gene expressions during the embryonic and larval development of O.potamophila

圖7 河川沙塘鱧不同生長(zhǎng)階段GHR和IGF-2在肝（A）、腦（B）、肌肉（C）中表達(dá)量的雌雄對(duì)比Fig.7 Expression differences of GHR and IGF-2 in O.potamophila liver（A），brain（B）and muscle（C）between themale and fem ale

和大多數(shù)硬骨魚的GHR一樣，河川沙塘鱧GHR的胞外區(qū)有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1個(gè)FGEFSmotif，其中半胱氨酸殘基可形成3個(gè)內(nèi)部二硫鍵，未配對(duì)的半胱氨酸可能在GH誘導(dǎo)的GH受體二聚化過程中形成二硫鍵［19］。此外，F(xiàn)GDFSmotif靠近跨膜區(qū)，其在GH與GHR結(jié)合過程中起穩(wěn)定空間構(gòu)象的作用，能保證配體與受體的正常結(jié)合以及進(jìn)一步的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并參與GHR的二聚化［3］，這是已知魚類GHR的共性之一。GHR胞內(nèi)含有特征結(jié)構(gòu)高度保守的BOX1、BOX2基序，BOX1區(qū)域是JAK2結(jié)合的位點(diǎn)，而BOX2區(qū)域參與受體的增殖反應(yīng)，推測(cè)這兩個(gè)區(qū)域在河川沙塘鱧GH所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。與哺乳動(dòng)物相比BOX1中的保守序列PPVPVP在河川沙塘鱧的GHR基因中為PPIPAP，這種微小的改變也在其他魚中被發(fā)現(xiàn)［20-21］，這種改變可能是GHR基因適應(yīng)不同物種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的結(jié)果。自從PALAMARCHU等［15］在大麻哈魚中首次克隆出魚類的IGF-2基因，許多學(xué)者開始了對(duì)其生物學(xué)的研究。IGF-2前體蛋白由N端至 C端的信號(hào)肽、B、C、A、D、E區(qū)構(gòu)成，切除信號(hào)肽和 E區(qū)導(dǎo)致轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祀模?2］。在本實(shí)驗(yàn)中，河川沙塘鱧IGF-2基因全長(zhǎng)1 586 bp，編碼212個(gè)氨基酸，成熟肽為71個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，河川沙塘鱧GHR先與大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）聚為一支，再與青鳉（Oryzias latipes）、雜色鳉（Cyprinodon variegatus）聚為一支。而IGF-2則自己聚為一支，后與亞馬遜花鳉（Poecilia formosa）等聚為一支。聚類分析產(chǎn)生的進(jìn)化樹基本上與各參考物種的分類進(jìn)化地位相吻合，由此可以在一定程度上推測(cè)河川沙塘鱧的系統(tǒng)進(jìn)化地位。

許多硬骨魚類GHR和IGF-2基因都具有廣泛表達(dá)的特性，如在暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、金頭雕 （Sparus aurata）、多 耙 牙 鲆 （Paralichthys adspersus）中［20，23-24］，在本 研 究 中 河 川 沙塘 鱧GHR基因在9個(gè)組織中均有表達(dá)，這與之前的研究是相一致的。GHR在多種組織中都有組織表達(dá)的模式支持了魚類GHR具有多種生理功能的觀點(diǎn)。TSE等［26］對(duì)鯽的研究表明IGF-2廣泛分布于腦、鰓、心臟、頭腎、肝臟、脾臟、腸，其中在肝臟中的表達(dá)量最高，這與已研究物種莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）的IGF-2在肝中的表達(dá)量最高相一致［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)河川沙塘鱧GHR、IGF-2基因在檢測(cè)的9個(gè)組織中肝臟的表達(dá)量最高，表明GHR、IGF-2主要在肝中產(chǎn)生；其次，肝臟是GHR與GH結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最重要的組織，也是魚類和其他哺乳類IGFs轉(zhuǎn)錄的主要位點(diǎn)，這也可能是GHR、IGF-2基因在肝臟中高豐度表達(dá)的原因。魚類未受精卵中存在來自于母源保存和傳遞的 IGF-1和IGF-2 mRNA，對(duì)于進(jìn)行體外受精和發(fā)育的硬骨魚類來說，這些母源傳遞的mRNA對(duì)于胚胎發(fā)育具有重要作用［27］。在很多硬骨魚 類中如 虹鱒［28］、斑馬魚［29］、金頭鯛［27］、半滑舌鰨［23］中 IGF-2和 GHR基因在胚胎發(fā)育過程中均持續(xù)表達(dá)。EIVERS等［30］在斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn) IGF-2和 IGF-1 mRNA在胚胎發(fā)育的原腸期存在表達(dá)，表明IGF-2對(duì)早期胚體發(fā)育模式的建立具有重要作用。WHITE［31］在斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn)GHR在原腸胚期表達(dá)量最高，作為介導(dǎo)GH通路的重要組件，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。然而在IGF-2基因敲除實(shí)驗(yàn)中，IGF-2 mRNA在囊胚期及原腸期高表達(dá)，而敲除IGF-2基因后并未對(duì)原腸期胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響，提示IGF-2 mRNA盡管在原腸期高表達(dá)，但其翻譯成多肽實(shí)際發(fā)揮作用的時(shí)間可能要在原腸期之后［30］。河川沙塘鱧IGF-2和GHR基因在胚胎發(fā)育過程中均有表達(dá)，且在囊胚到原腸胚期表達(dá)量相對(duì)較高，這表明IGF-2和GHR基因在胚胎發(fā)育過程中扮演重要角色。

動(dòng)物的生長(zhǎng)軸基因在控制機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝的過程中發(fā)揮著不可替代的作用，其生長(zhǎng)軸基因的表達(dá)存在雌雄二態(tài)性，是導(dǎo)致雌雄生長(zhǎng)速度具有顯著差異性的原因之一，在魚類中這種兩性生長(zhǎng)差異更加明顯，例如黃顙魚（Pseudobagrus vachelli）雄性個(gè)體生長(zhǎng)明顯快于雌性個(gè)體，而鱖（Siniperca chuatsi）雌魚生長(zhǎng)速度快于其雄魚［32-33］。河川沙塘鱧在生長(zhǎng)方面也具有明顯的性別二態(tài)性，雄性河川沙塘鱧比雌性同期生長(zhǎng)速度快30%以上。針對(duì)這一問題本研究檢測(cè)了河川沙塘鱧生長(zhǎng)相關(guān)基因GHR和IGF-2在雌、雄魚不同生長(zhǎng)階段的相關(guān)組織腦、肝、肌肉中的表達(dá)情況，結(jié)果表明在河川沙塘鱧快速生長(zhǎng)期雄魚肝中GHR、IGF-2基因表達(dá)量均顯著高于雌魚，這與黃顙魚的研究結(jié)果一致［32］，說明河川沙塘鱧的生長(zhǎng)與GHR、IGF-2的調(diào)控作用是密切相關(guān)的。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，GHR可以通過GH/IGF生長(zhǎng)內(nèi)分泌軸促進(jìn)動(dòng)物組織細(xì)胞的分化與生長(zhǎng)，例如MA等［23］對(duì)比了半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期雌、雄魚肝臟中GHR基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段在雄魚中的表達(dá)量均高于雌魚。大麻哈魚［24］、斑點(diǎn)叉尾鮰［34］、尼羅羅非魚［17］禁食后肝 GHR mRNA表達(dá)量均下降，降低了GH對(duì)魚的促生長(zhǎng)作用，使魚類的生長(zhǎng)變慢。在鯉（Cyprinus carpio）中注射GH后，腦、胰臟和肝中IGFs的表達(dá)量均顯著上升［26］。CHEN等［17］對(duì)尼羅羅非魚的研究表明，每周注射IGF1和IGF2，到第5周時(shí)尼羅羅非魚體長(zhǎng)和體質(zhì)量都明顯升高。在河川沙塘鱧中GHR基因在不同發(fā)育時(shí)期肝組織中的表達(dá)量有很大的差異，IGF-2在肝中的表達(dá)量也存在明顯的雌、雄二態(tài)性，說明IGFs在肝臟中的高表達(dá)與肝臟在產(chǎn)生IGFs和發(fā)揮IGFs生理功能方面起關(guān)鍵作用是一致的。GHR和IGF-2基因在河川沙塘鱧腦和肌肉中的大多數(shù)發(fā)育階段沒有顯著性差異，因此筆者推測(cè)肝中GHR和IGF-2基因表達(dá)的雌、雄差異可能是導(dǎo)致河川沙塘鱧生長(zhǎng)性別二態(tài)性的主要原因。本文為研究河川沙塘鱧生長(zhǎng)提供了分子生物學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究魚類生長(zhǎng)基因的調(diào)控機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。