集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表達(dá)分析

張燕 岳壽松 陳高 游銀偉 鐘懷榮 于金慧

摘要：組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶上調(diào)表達(dá)與抗逆性有一定相關(guān)性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一個(gè)未知蛋白，預(yù)測(cè)其屬于組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶GNAT家族N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶。為了進(jìn)一步明確slr1501基因功能，本研究從集胞藻6803中克隆slr1501基因，成功構(gòu)建了pET-28a（+）-slr1501原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行分析。經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h后Slr1501蛋白成功表達(dá)，表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且主要以包涵體形式表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Slr1501重組蛋白特異性表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：集胞藻6803; 乙酰基轉(zhuǎn)移酶; slr1501; 原核表達(dá); 基因功能

中圖分類號(hào)：S555+.6：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）07-0001-05

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 （以下簡(jiǎn)稱集胞藻6803）歸屬于藍(lán)藻門集胞藻屬，是一種單細(xì)胞藍(lán)藻，其基因組序列遺傳背景清楚、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是基因工程研究的模式藻類。Slr1501是集胞藻6803中的一個(gè)未知蛋白，根據(jù)序列相似性和相應(yīng)蛋白功能比對(duì)結(jié)果，預(yù)測(cè)其為組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶GNAT家族N-乙?；D(zhuǎn)移酶（http：//bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase）。組蛋白乙?；山M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDAC）共同參與，過程動(dòng)態(tài)可逆。組蛋白乙?；潜碛^遺傳調(diào)控的重要機(jī)制，在HAT的作用下，將乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)受體氨基酸位點(diǎn)的過程，是細(xì)胞控制基因表達(dá)、蛋白質(zhì)活性或生理過程的一種機(jī)制[1]。HAT對(duì)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活起到非常重要的作用，已證實(shí)乙?；瘏⑴c原核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[2]。

集胞藻6803 slr1501與逆境適應(yīng)相關(guān)，如鹽脅迫、滲透脅迫、酸脅迫和堿脅迫等[3-7]。當(dāng)轉(zhuǎn)至pH值為10條件下，集胞藻6803細(xì)胞中slr1501轉(zhuǎn)錄水平升高;而再次轉(zhuǎn)至中性pH值條件時(shí)，slr1501轉(zhuǎn)錄水平迅速下降至高pH條件時(shí)表達(dá)水平的1/40左右，1 h后，檢測(cè)不到slr1501的表達(dá)。這種快速的基因表達(dá)反應(yīng)，目前尚未在其它pH逆境反應(yīng)相關(guān)基因中發(fā)現(xiàn)[6]。slr1501可能在更大范圍的逆境適應(yīng)中具有潛在作用，它的表達(dá)上調(diào)不僅只發(fā)生在pH值升高時(shí)，在高鹽、黑暗、冷脅迫、熱脅迫、缺鐵、缺氮、缺磷等逆境條件，特別是強(qiáng)光下上調(diào)最顯著[8]。但Taylor[7]的研究表明，在多重逆境（如高鹽、高光和高滲透壓）條件下，slr1501基因?qū)?803細(xì)胞生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控效應(yīng);在單逆境高pH條件下，缺失slr1501基因時(shí)，集胞藻6803細(xì)胞的生長(zhǎng)不受影響。

目前，對(duì)集胞藻6803 slr1501的研究多停留在各種逆境條件下該基因的表達(dá)水平及抗逆反應(yīng)上[3-7]，具體功能并未開展研究?；诖?，本研究擬通過構(gòu)建pET-28a（+）-slr1501表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)Slr1501蛋白，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

集胞藻Synechocystis 6803基因組，本實(shí)驗(yàn)室提取保存;pET-28a（+）載體，本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌DH5α和BL21 （DE3）感受態(tài)，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒回收試劑盒均購自O(shè)MEGA公司;限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司;PCR擴(kuò)增高保真酶和PCR檢測(cè)用酶均購自青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司;his tag兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗和ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 slr1501基因克隆

根據(jù)Cyanobase中集胞藻6803基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增slr1501基因全長(zhǎng)引物：slr1501-NdeⅠ-F：5′-ACTCCATATGGTGATGTCAACCACGCTAAA-3′和slr1501-XhoⅠ-R：5′-ACTCCTCGAGTTAGTTGAGACGCATACCAA-3′，上下游引物5′端分別引入NdeⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)（下劃線處）。由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成引物。

以集胞藻6803基因組DNA為模板，對(duì)slr1501基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：I5 PCR mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。

1.4 pET-28a（+）-slr1501載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

分別用NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切slr1501目的基因和 pET-28a（+）質(zhì)粒，后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因和pET-28a（+）線性片段。經(jīng)T4 DNA連接酶16℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Kan抗性篩選。挑取單克隆進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，并將陽性克隆送至青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序正確的pET-28a（+）-slr1501質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，用Kan抗性進(jìn)行篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

挑取含有重組質(zhì)粒pET-28a（+）-slr1501的BL21（DE3）陽性菌落接種于5 mL含Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩（180 r/min）過夜培養(yǎng)。取培養(yǎng)過夜的菌液按照1∶100的接種量接種至新的含Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基上，37℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，至菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加IPTG（終濃度為1 mmol/L）開始誘導(dǎo)Slr1501蛋白表達(dá)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)開始后0、2、4、6 h取 1 mL菌液離心收集菌體，加入100 μL的1% SDS，重懸菌體，70℃孵育10 min，后加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，混勻后于沸水中煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE（12%分離膠，5%濃縮膠）電泳，90 V恒壓至樣品跑至分離膠內(nèi)時(shí)，電壓調(diào)至120 V，直至蛋白電泳結(jié)束。收集誘導(dǎo)6 h的pET-28a（+）-slr1501菌液3 mL，離心后加1 mL PBS懸浮菌體進(jìn)行超聲破碎，分別將上清和沉淀SDS-PAGE電泳，檢測(cè)誘導(dǎo)的Slr1501重組蛋白可溶性。