張博森，趙汗青，高峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的重要組分，同時(shí)也是自然界中存在最豐富的天然多糖之一[1]。細(xì)胞壁作為真菌的細(xì)胞外骨架結(jié)構(gòu)不僅在維持細(xì)胞形態(tài)、幫助細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境發(fā)揮重要作用[2]，同時(shí)也在病原真菌的生長(zhǎng)發(fā)育、入侵新的生態(tài)域、啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)中也起重要作用[3-5]。因此，細(xì)胞壁組分是開發(fā)抗真菌藥物的理想靶標(biāo)[6,7]。

棉花黃萎病是由半知菌亞門真菌大麗輪枝菌引起土傳維管束病害，該菌可以侵染包括棉花、向日葵、馬鈴薯在內(nèi)的200多種重要經(jīng)濟(jì)作物[8]。由于棉花黃萎病菌具有變異快、抗逆性強(qiáng)、陸地棉中缺乏抗原等特點(diǎn)，目前沒有有效的防治手段[9]，被廣大棉農(nóng)稱為“棉花癌癥”。

殼聚糖是幾丁質(zhì)在幾丁質(zhì)脫乙酰酶作用下脫掉乙?；蟮漠a(chǎn)物[10]，多項(xiàng)研究[11,12]表明幾丁質(zhì)和殼聚糖在真菌和果蠅不同發(fā)育階段的細(xì)胞壁構(gòu)成中是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。例如稻瘟菌分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管的細(xì)胞壁主要成分并不是幾丁質(zhì)而是殼聚糖[12]。本課題組前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌基因組中編碼6個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶，但是大麗輪枝菌不同發(fā)育階段的細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和殼聚糖的構(gòu)成尚未見報(bào)道。

卡爾科弗盧爾熒光增白劑染液(Calcofluor White Stain，CFW)能與含β-1,4-糖苷鍵的幾丁質(zhì)結(jié)合，可吸收紫外光，使菌絲和孢子發(fā)出明亮的熒光，其熒光強(qiáng)度與結(jié)合幾丁質(zhì)的量成正比，在熒光顯微鏡下可直接進(jìn)行觀察[14,15]。殼聚糖抗體是近期開發(fā)的一種特異性結(jié)合殼聚糖的抗體，因其與Alexa 488耦合，可被488 nm的激光激發(fā)出明亮的熒光，其熒光強(qiáng)度與結(jié)合殼聚糖的量成正比，可在熒光顯微鏡下直接觀察[11]。因此使用CFW染色和殼聚糖抗體標(biāo)記技術(shù)研究大麗輪枝菌棉花黃萎病菌不同發(fā)育階段細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和殼聚糖的構(gòu)成具有技術(shù)可行性，同時(shí)本研究對(duì)于深入了解其發(fā)育生物學(xué)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試野生型菌株為強(qiáng)致病力大麗輪枝菌菌株V592(由石河子大學(xué)植物病理教研室提供)。

殼聚糖抗體(偶聯(lián)Alexa Fluor fluorophore 488)由本實(shí)驗(yàn)室制備；Calcofluor White Stain購(gòu)自Sigma-Aldrich(CAS:18909)；纖維素膜購(gòu)自索萊寶(CAS:YA0620)，NaNO3、K2HPO4和檸檬酸等其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基

PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基、Czapek′s液體培養(yǎng)基參照Z(yǔ)hao[16]的方法配置。

M0固體培養(yǎng)基：NaNO32 g，KH2PO41 g，MgSO4-7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，檸檬酸 10 mg，ZnSO4-7H2O 10 mg，F(xiàn)eSO4-7H2O 10 mg，NH4Fe(SO4)2-12H2O 2.6 mg，CuSO4-5H2O 0.5 mg，MnSO4-H2O 0.1 mg，H3BO30.1 mg，Na2MoO4-2H2O 0.1 mg，葡萄糖 2 g，1.5%瓊脂，加蒸餾水至1 L,113 ℃，高壓滅菌20 min[17]。

1.3 樣品準(zhǔn)備

分生孢子：將6～8塊直徑為約為1 cm的V592菌株的菌餅接種于Czapek′s液體培養(yǎng)基中，26 ℃，200 rpm避光搖培2 d，經(jīng)4層紗布過濾收集孢子。將收集好的孢子懸浮于20%的甘油中，終濃度為1×108 cfu/ml。

芽管：將制備的分生孢子滴在載玻片上，26 ℃避光孵育2 h，使孢子在載玻片上萌發(fā)形成芽管，期間通過顯微鏡觀察確定其萌發(fā)狀態(tài)。

菌絲：用無菌刀片在V592菌株的菌落邊緣劃取直徑約為5 mm的菌餅，倒置于載玻片上，將載玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，26 ℃避光保濕培養(yǎng)72 h。

侵染結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)：將纖維素膜平鋪于M0培養(yǎng)基上，將制備好的V592孢子接種于纖維素膜上，然后26 ℃避光培養(yǎng)72 h后，用手術(shù)刀切取部分長(zhǎng)有菌絲的纖維素膜置于載玻片上備用。

1.4 幾丁質(zhì)和殼聚糖的標(biāo)記和觀測(cè)方法

探針孵育：將殼聚糖抗體母液按照1∶1000的比例稀釋于PBS中，然后將待觀測(cè)樣品在稀釋好的探針中室溫、避光孵育15 min后，用PBS溶液漂洗3遍，確保將非結(jié)合狀態(tài)的抗體沖洗干凈[11]。

檢測(cè)使用激光共聚焦顯微鏡Leica SP8使用100倍油鏡，Alexa Fluor fluorophore 488使用488 nm激光激發(fā)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為617 nm。被殼聚糖抗體標(biāo)記上的殼聚糖，在488 nm下可激發(fā)出綠色熒光。

CFW染色：將待觀測(cè)放置于含有10% KOH的Calcofluor White Stain中，蓋上蓋玻片室溫、避光孵育1 min[18]。

檢測(cè)使用激光共聚焦顯微鏡Leica SP8使用100倍油鏡，CFW使用UV 405 nm 激光激發(fā)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為500 nm。被CWF標(biāo)記上的幾丁質(zhì)，在405 nm下可激發(fā)出藍(lán)色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麗輪枝菌分生孢子細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和殼聚糖的觀測(cè)

分別用CFW和 殼聚糖抗體對(duì)分生孢子細(xì)胞壁進(jìn)行染色和觀測(cè)，結(jié)果見圖1，在沒有萌發(fā)的孢子的細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)(圖1 A)；通過特異性結(jié)合殼聚糖的探針標(biāo)記沒有檢測(cè)到分生孢子的細(xì)胞壁上具有殼聚糖(圖1B)。這些結(jié)果表明，在大麗輪枝菌的分生孢子的細(xì)胞壁的組分中只含有幾丁質(zhì)，而沒有殼聚糖。

2.2 大麗輪枝菌萌發(fā)狀態(tài)下的分生孢子細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和殼聚糖的檢測(cè)

分別用CFW和殼聚糖抗體對(duì)萌發(fā)狀態(tài)下的分生孢子細(xì)胞壁進(jìn)行染色和觀測(cè)，結(jié)果如圖2所示。大麗輪枝菌的分生孢子除萌發(fā)點(diǎn)細(xì)胞壁沒有幾丁質(zhì)外，其它位置均含有幾丁質(zhì)(圖2 A)；而抗體標(biāo)記的殼聚糖主要存在于分生孢子的萌發(fā)點(diǎn)位置(星號(hào)標(biāo)記的位置)(圖2B)。上述結(jié)果表明，在大麗輪枝菌分生孢子萌發(fā)過程中，萌發(fā)點(diǎn)位置細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)需要被脫乙酰化形成殼聚糖。

A—CFW染色分生孢子細(xì)胞壁幾丁質(zhì)；B—?dú)ぞ厶强贵w標(biāo)記分生孢子細(xì)胞壁殼聚糖。圖1 大麗輪枝菌分生孢子染色和探針標(biāo)記Fig.1 Conidia staining and labeling in V.dahliae

A—CFW染色分生孢子萌發(fā)細(xì)胞壁幾丁質(zhì)；B—?dú)ぞ厶强贵w標(biāo)記分生孢子萌發(fā)細(xì)胞壁殼聚糖；星號(hào)*指示萌發(fā)點(diǎn)。圖2 大麗輪枝菌孢子萌發(fā)染色和探針標(biāo)記Fig.2 Conidia germinationstaining and labeling in V.dahliae

2.3 大麗輪枝菌芽管細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和殼聚糖的檢測(cè)

大麗輪枝菌的芽管細(xì)胞壁的染色和觀測(cè)結(jié)果見圖3。經(jīng)CFW染色后，大麗輪枝菌芽管細(xì)胞壁上出現(xiàn)藍(lán)色熒光，但強(qiáng)度弱于分生孢子，說明芽管細(xì)胞壁上存在幾丁質(zhì)但含量低于分生孢子細(xì)胞壁(圖3A)；經(jīng)殼聚糖抗體標(biāo)記后，觀測(cè)發(fā)現(xiàn)芽管細(xì)胞壁中存在殼聚糖(圖3B)。這些研究結(jié)果表明，芽管細(xì)胞壁組分中幾丁質(zhì)和殼聚糖是同時(shí)存在的。

2.4 大麗輪枝菌菌絲細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和殼聚糖檢測(cè)

大麗輪枝菌的菌絲細(xì)胞壁的標(biāo)記和觀測(cè)結(jié)果見圖4，大麗輪枝菌菌絲細(xì)胞壁上存在幾丁質(zhì)(圖4A)的同時(shí)也存在殼聚糖(圖4B)，但隔膜上只存在幾丁質(zhì)而不存在殼聚糖(圖4B)。

2.5 大麗輪枝菌侵染結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和殼聚糖檢測(cè)

大麗輪枝菌侵染結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁染色和標(biāo)記的結(jié)果見圖5，侵染結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁組分中是幾丁質(zhì)與殼聚糖是一種共存狀態(tài)。

A—CFW染色芽管細(xì)胞壁幾丁質(zhì)；B—?dú)ぞ厶强贵w標(biāo)記芽管細(xì)胞壁殼聚糖。圖3 大麗輪枝菌芽管染色和探針標(biāo)記Fig.3 Germ tubestaining and labeling in V.dahliae

A—CFW染色菌絲細(xì)胞壁幾丁質(zhì)；B—?dú)ぞ厶强贵w標(biāo)記菌絲細(xì)胞壁殼聚糖。圖4 大麗輪枝菌細(xì)胞壁的染色和探針標(biāo)記Fig.4 Myceliumstaining and labeling in V.dahliae

A—CFW染色侵染釘細(xì)胞壁，星號(hào)指示的是侵染釘；B—?dú)ぞ厶强贵w標(biāo)記附著枝細(xì)胞壁，星號(hào)指示的是附著枝。圖5 大麗輪枝菌侵染結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的染色和探針標(biāo)記Fig.5 Hyphopodia and penetration pegsstaining and labeling in V.dahliae

3 結(jié)論與討論

本文對(duì)大麗輪枝菌不同發(fā)育階段細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和殼聚糖的構(gòu)成進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，不同發(fā)育階段的細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和殼聚糖的含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。

在實(shí)驗(yàn)操作過程中，因?yàn)锳lexa 488是一種化學(xué)熒光染料，在室溫和光照條件下容易降解和猝滅，所以在使用殼聚糖抗體過程中要注意緩沖體系的PH值，在儲(chǔ)存探針和標(biāo)記過程中要全程避光并且在冰上操作，標(biāo)記完成后要使用干凈的PBS溶液進(jìn)行多次沖洗，這樣才能得到比較理想的觀測(cè)結(jié)果。

我們觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌分生孢子萌發(fā)前，萌發(fā)點(diǎn)位置細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)換成了殼聚糖，產(chǎn)生的芽管細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量相比殼聚糖也明顯偏低，這與稻瘟菌的研究[12]相一致。在酵母(S.cerevisiae)及隱球菌(C.neoformans)的研究[19,20]中發(fā)現(xiàn),在缺少殼聚糖的情況下，分生孢子的生長(zhǎng)并沒有受到影響，但細(xì)胞壁的穩(wěn)定性受到了很大的破壞，說明殼聚糖對(duì)細(xì)胞壁的穩(wěn)定性有著至關(guān)重要的影響。因此，我們推測(cè)在殼聚糖出現(xiàn)在芽管和萌發(fā)點(diǎn)位置的細(xì)胞壁上可能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相關(guān)。侵染結(jié)構(gòu)是病原與寄主互作的最主要界面，在大麗輪枝菌的侵染結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁中存在一定量的殼聚糖，我們推測(cè)這可能與輪枝菌逃避寄主來源的幾丁質(zhì)酶對(duì)細(xì)胞壁的剪切相關(guān)。