司晨晨， 徐步芳， 樊為民， 張愛軍

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200025）

雌二醇（estradiol，E2）濃度的測定被廣泛應(yīng)用于疾病的輔助診斷及臨床治療監(jiān)測[1-2]，尤其在生殖醫(yī)學(xué)中，E2測定可用于輔助評估卵巢功能儲備、月經(jīng)周期、體外受精胚胎移植預(yù)后等，以及監(jiān)測控制性超排卵、卵巢過度刺激綜合征和促性腺激素的治療[3]。

目前，多種技術(shù)可用于檢測E2濃度，主要有化學(xué)發(fā)光免疫法、高效液相色譜法、放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法等[4]。其中，化學(xué)發(fā)光免疫法因其自動化程度高、及時性高、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點，被臨床廣泛使用。常用的全自動化學(xué)發(fā)光免疫法（UniCel DXI 800）檢測E2的線性范圍為20～4 800 pg/mL，而在臨床檢測中，尤其是輔助生殖領(lǐng)域，多數(shù)患者經(jīng)過控制性超排卵和促性腺激素治療后，其E2水平遠(yuǎn)高于上述線性檢測范圍。以我院生殖醫(yī)學(xué)中心為例，在長達(dá)10年的臨床檢測工作中，有15%～20%的臨床標(biāo)本超出線性檢測范圍，必須經(jīng)手工稀釋后再次檢測。

目前已有的E2稀釋介質(zhì)中，常見的有儀器配套的S0定標(biāo)液、標(biāo)準(zhǔn)樣本稀釋液、混合低值血清、生理鹽水等。由于與檢測儀器配套的S0定標(biāo)液價格昂貴，對于標(biāo)本檢測量較大的實驗室有一定經(jīng)濟壓力，且僅用S0稀釋又造成定標(biāo)品S1～S6的浪費。目前已有對E2稀釋介質(zhì)的比較研究，但由于各研究對于E2最佳替代稀釋介質(zhì)的選擇存在爭議[5-7]，目前尚無統(tǒng)一建議。本實驗室在長期的臨床檢測工作中發(fā)現(xiàn)，以往研究報道的低值混合血清及生理鹽水均與儀器標(biāo)準(zhǔn)稀釋液S0的稀釋結(jié)果間差異較大；同時，雖然目前有其他品牌的商用樣品稀釋液，但其稀釋結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性等方面均未得到臨床實驗證實。新生牛血清成分與人血清成分相似，且血清的生產(chǎn)工藝嚴(yán)格，價格低廉且性能穩(wěn)定，是潛在的優(yōu)質(zhì)稀釋介質(zhì)，但目前尚未有使用新生牛血清進行E2稀釋的報道。因此，本研究擬對貝克曼定標(biāo)品S0、商品E2/孕酮稀釋液、人低值混合血清（E2＜50 pg/mL）及新生牛血清的稀釋結(jié)果進行比對分析，旨在評價不同稀釋液對化學(xué)發(fā)光免疫法測定E2濃度的影響，綜合多種統(tǒng)計分析方法，以尋求最佳的臨床替代稀釋液。

材料與方法

一、材料

1．儀器：采用貝克曼庫爾特公司UniCel Dxi800全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，序列號604925。

2．試劑：所用試劑包括儀器配套的定標(biāo)品S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（貝克曼，批號624266，有效期至2017年3月）；商品 E2/孕酮稀釋液(羅氏，批號 190270-01，有效期至2016年09月，以下簡稱商品稀釋液)；新生牛血清 （浙江天杭生物科技有限公司，批號2016063108， 有效期至 2021 年 6 月，E2＜50 pg/mL）；低值混合血清（實驗室自制，現(xiàn)配現(xiàn)用）；BIO-RAD質(zhì)控品（批號40320，有效期至2018年5月）；貝克曼Dxi800配套試劑（批號536963，有效期至2017年2月）。

3．標(biāo)本來源及低值混合血清的制備：收集2016年6月至2016年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心收治的50例患者的新鮮全血樣本，離心留取血清待測。50例標(biāo)本的原始測量值中，包括線性范圍內(nèi)樣本（＜4 800 pg/mL）12例，超出線性范圍（＞4 800 pg/mL）38例。制備低值混合血清時，收集多管生化指標(biāo)正常、無污染、無纖維凝塊及化學(xué)發(fā)光免疫法檢測E2＜50 pg/mL的低值血清，充分混勻后再次檢測E2濃度，確保E2＜50 pg/mL，分裝、待用。

二、方法

1．精密度評估及線性范圍驗證：采用BIO-RAD質(zhì)控品和Unity Real Time質(zhì)控軟件對本實驗檢測儀器的精密度進行評估和室間比對，評估結(jié)果均符合實驗要求。同時按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會CLSI EP6-A文件《定量測定項目的線性評價》中要求驗證E2測定的線性范圍[8-9]，驗證結(jié)果符合試劑說明書要求，即20～4 800 pg/mL。

2．稀釋方案：待測樣品平均分成4等份，分別使用配套的S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（S0標(biāo)準(zhǔn)組）、低值混合血清（低值血清組）、商品E2/孕酮稀釋液（商品稀釋液組）和新生牛血清（牛血清組）作為稀釋介質(zhì)，由于待測樣本總體積有限，對于E2濃度超出檢測范圍（4 800 pg/mL）的標(biāo)本，先進行 1∶1 稀釋，若稀釋結(jié)果仍超出檢測范圍，則進行1∶4稀釋，同時每管均設(shè)平行管。

3．統(tǒng)計學(xué)處理：配對t檢驗計算3種替代稀釋介質(zhì)的檢測值與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液之間的差異；使用2個復(fù)管的平均值作為對應(yīng)樣本的實際檢測值，采用Shapiro-Wilk檢驗對不同分組的數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分布檢驗，數(shù)據(jù)分布采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；使用Pearson相關(guān)性分析計算不同稀釋介質(zhì)組與S0標(biāo)準(zhǔn)組的相關(guān)系數(shù)，并擬合線性回歸方程，然后用配對t檢驗計算線性擬合后的數(shù)值與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋值之間的差異；不同稀釋方案間的一致性比較采用Bland-Altman檢驗，并計算替代稀釋液組與S0稀釋液組之間的相對偏倚；數(shù)據(jù)分析采用 R 3．3．1和SPSS 19．0 統(tǒng)計分析軟件， P＜0．05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3種替代稀釋介質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)稀釋液S0的結(jié)果比較

經(jīng)配對t檢驗發(fā)現(xiàn)，牛血清組、商品稀釋液組及低值血清組與S0標(biāo)準(zhǔn)組比較，稀釋后的檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P 值依次為 5．03×10-11、1．44×10-10及 2．79×10-13）。

二、校正后的3種替代稀釋介質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)稀釋液S0檢測結(jié)果間的相關(guān)性

使用線性回歸方程對3種替代稀釋介質(zhì)的檢測結(jié)果進行校正，并用Pearson相關(guān)性檢驗分析其與標(biāo)準(zhǔn)組檢測結(jié)果間的相關(guān)性，具體組間差值、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果顯示，牛血清組與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的相對差值在所有替代稀釋介質(zhì)組中最低，而其相關(guān)系數(shù)及決定系數(shù)在所有替代稀釋介質(zhì)組中最高。圖1為不同稀釋介質(zhì)與S0之間的相關(guān)性分析，其中牛血清組表現(xiàn)出最高的相關(guān)性。在上述分析中，牛血清組均表現(xiàn)出最佳的統(tǒng)計學(xué)效能。

三、不同稀釋介質(zhì)組內(nèi)及校正后數(shù)值與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的差值分析

為校驗各替代稀釋介質(zhì)在實際臨床檢測中的準(zhǔn)確率，對不同稀釋介質(zhì)組內(nèi)重復(fù)管之間進行配對t檢驗，結(jié)果顯示，S0標(biāo)準(zhǔn)組、牛血清組、商品稀釋液組及低值血清組的組內(nèi)重復(fù)管之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 值分別為 0．47、0．44、0．31、0．07）。

用線性回歸模型分別對牛血清組、商品稀釋液組及低值血清組的初始測定數(shù)值進行校正，將校正后的數(shù)值與S0標(biāo)準(zhǔn)組分別進行配對t檢驗，結(jié)果如圖2所示，校正后3種稀釋介質(zhì)的檢測結(jié)果數(shù)值與S0標(biāo)準(zhǔn)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0．998 3、0．997 9、0．987 7）。

圖1 替代稀釋介質(zhì)與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液檢測結(jié)果的回歸直線

四、3種替代稀釋介質(zhì)與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液間的一致性評價

為進一步從3種替代稀釋介質(zhì)中評估出最優(yōu)方案，使用Bland-Altman一致性檢驗將3種替代稀釋介質(zhì)組與S0標(biāo)準(zhǔn)組進行比較，結(jié)果見圖2（圖2A～C依次為小牛血清、商品稀釋液和混合低值血清）。牛血清組與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的一致性比較中，有2%（1/50）的點在95%一致性界限以外，而在一致性界限范圍內(nèi)，比值的最大值為105．22%，最小值為83．51%。商品稀釋液組與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的一致性比較中，有6%（3/50）的點在95%一致性界限以外；在一致性界限范圍內(nèi)，比值的最大值為98．01%，最小值為55．16%。低值血清組與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的一致性比較中，有8%（4/50）的值在95%一致性界限以外，在一致性界限范圍內(nèi)，比值的最大值為98．71%，最小值為 54．81%。

表1 替代稀釋介質(zhì)組與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的E2濃度差值及回歸方程

在一致性檢驗結(jié)果中（見表2），牛血清組超出一致性區(qū)間的樣本比例最低，最大偏差最??；相關(guān)性檢驗中，牛血清組與S0標(biāo)準(zhǔn)組間的相關(guān)系數(shù)最高；穩(wěn)定性評價中，牛血清組的內(nèi)重復(fù)值間無差異。結(jié)果提示新生牛血清的綜合效能在3種替代稀釋介質(zhì)中最優(yōu)。

圖2 Bland-Altman一致性檢驗

表2 替代稀釋介質(zhì)組綜合效能評價

討 論

一、E2檢測的廣泛應(yīng)用及其稀釋困境

作為基礎(chǔ)性激素，E2水平可以評估卵巢功能和月經(jīng)周期；在促排卵早期，E2水平的變化能提前預(yù)測卵巢反應(yīng)。當(dāng)E2值上升緩慢或者不上升，可提示卵巢反應(yīng)較差，結(jié)合卵泡生長情況，輔助指導(dǎo)臨床及時調(diào)整促性腺激素（gonadotropin,Gn）劑量。促排卵第6天的E2水平是衡量卵巢反應(yīng)性，界定低反應(yīng)的重要參數(shù)。實際臨床診療中，檢測E2水平的重要性主要體現(xiàn)在以下兩方面。一是，Gn劑量未變化而出現(xiàn)自發(fā)性E2下降，以及中斷卵泡刺激素（coasting方案）時E2下降，此時提示獲卵數(shù)少、新鮮周期移植妊娠率下降，在排除早發(fā)黃素化后，提示臨床需及時增加Gn劑量。另一種情況是，在降調(diào)節(jié)方案中，降低E2水平至預(yù)期后才注射人絨毛膜促性腺激素，這是預(yù)防卵巢過度刺激綜合征的重要手段，故動態(tài)監(jiān)測E2濃度下降幅度非常關(guān)鍵[10-11]。血清E2濃度的精準(zhǔn)檢測具有非常重要的臨床意義。

UniCel DXI 800全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是目前臨床常用的性激素分析儀之一[12-13]，但該系統(tǒng)測定血清E2水平的線性范圍僅為20~4 800 pg/mL，當(dāng)出現(xiàn)多個卵泡同時發(fā)育時，E2的水平往往超出該線性范圍，必須要稀釋后才能夠測定其真實濃度。因此，評估并選取最合適的稀釋介質(zhì)才可以使稀釋因素所導(dǎo)致的干擾最小化，得到最準(zhǔn)確的結(jié)果。儀器配套的樣本稀釋液S0雖準(zhǔn)確度高，對結(jié)果影響較小[5]，但價格昂貴，且不單獨出售，臨床標(biāo)本量大的實驗室?guī)缀醵际褂锰娲♂尳橘|(zhì)來進行標(biāo)本稀釋，因此，急需尋找和驗證最佳的替代稀釋介質(zhì)。

二、綜合分析顯示新生牛血清為3中替代稀釋介質(zhì)中最佳

本研究使用了新生牛血清、低值血清及商品稀釋液這3種臨床上常用或已有文獻(xiàn)報道的替代稀釋介質(zhì)，并將其與儀器配套的S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進行比較。使用配對t檢驗分析替代稀釋介質(zhì)與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液間檢測結(jié)果的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種替代稀釋介質(zhì)的檢測結(jié)果與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與已發(fā)表的部分研究結(jié)果有所不同[6]，考慮可是由于環(huán)境、儀器校準(zhǔn)、基質(zhì)效應(yīng)等原因，造成不同研究的檢測結(jié)果間存在一定程度的偏倚。

為證明此種差異是否能通過回歸方程進行校準(zhǔn)，本研究后續(xù)進行了相關(guān)性分析，并建立了線性回歸模型，用以驗證經(jīng)回歸方程校正后的檢測結(jié)果與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液間的差異。結(jié)果顯示，新生牛血清與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液間的相對差值在所有替代稀釋介質(zhì)組中最低，且Pearson相關(guān)系數(shù)在所有替代稀釋組中最高（r＞0．99）。將回歸模型校準(zhǔn)后的替代稀釋介質(zhì)與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的檢測結(jié)果再次進行配對t檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種替代稀釋介質(zhì)校正后的數(shù)值與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示替代稀釋介質(zhì)的檢測結(jié)果雖與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液之間存在差異，但其與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液呈線性相關(guān)，經(jīng)線性方程校正后的數(shù)值與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的測定結(jié)果間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，替代稀釋介質(zhì)可以用于激素的臨床檢測，但其結(jié)果需經(jīng)過校正，這與已經(jīng)發(fā)表的部分研究結(jié)果一致[5-7,14-15]。為從3種替代稀釋介質(zhì)中進一步評估出最優(yōu)的稀釋方案，本研究通過Bland-Altman法，比較3種替代稀釋介質(zhì)與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液之間的一致性。新生牛血清與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液間的一致性檢驗結(jié)果顯示，98%（49/50）的值在95%一致性界限以內(nèi)；而在一致性界限范圍內(nèi)，比值的最大值為 1．05，最小值為 0．83，即對于絕大多數(shù)標(biāo)本，S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液與新生牛血清之間稀釋后的檢測結(jié)果相差5%～17%。而對于大多數(shù)的標(biāo)本，S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液與低值血清之間稀釋后的檢測結(jié)果相差1%～45%，其差異較新生牛血清稀釋方案更為明顯；S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液與某商品稀釋液之間稀釋后的檢測結(jié)果相差2%～45%，其差異更為明顯。從臨床上考慮，需稀釋的標(biāo)本濃度均大于4 800 pg/mL，新生牛血清與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液之間的差異是可以接受的，兩者的檢測結(jié)果間具有較好的一致性。目前，用于評估2種測量結(jié)果一致性的方法有很多，而Bland-Altman一致性評價是評價方法學(xué)一致性的常用分析方法，其準(zhǔn)確率和靈敏度要優(yōu)于傳統(tǒng)的t檢驗、方差分析和相關(guān)性分析[16-17]。本研究通過綜合使用此3種評價方法，并重點從一致性檢驗的角度，科學(xué)地分析出新生牛血清為最佳的替代稀釋介質(zhì)。

三、3種替代稀釋介質(zhì)優(yōu)劣的原因分析

李洋等[6]比較了低值血清、生理鹽水作為替代稀釋介質(zhì)與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液之間的差異，認(rèn)為低值血清屬于較好的替代稀釋介質(zhì)。但以往研究中使用的人低值混合血清，只是經(jīng)過簡單的標(biāo)本篩選，并沒有進行各項理化性質(zhì)（脂質(zhì)、纖維蛋白、血黏度及血藥濃度等）的平衡和防腐處理，且血液成分復(fù)雜，個體差異大，來自不同個體的血清混合后，對檢測結(jié)果的影響更加不可預(yù)測，因此在本研究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，低值血清的偏差要大于新生牛血清，不建議作為首選的替代稀釋介質(zhì)。此外，雖然目前有標(biāo)準(zhǔn)化的商品E2/孕酮稀釋液，但本研究發(fā)現(xiàn)，因不同品牌的儀器間反應(yīng)原理不同，基質(zhì)效應(yīng)差異大，與S0標(biāo)準(zhǔn)稀釋液相比偏差較大，提示不同品牌稀釋液間不能隨意混用。因生理鹽水的基質(zhì)效應(yīng)較大[7]，結(jié)果偏差明顯，故本研究中沒有對生理鹽水進行比較分析。

新生牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)液已為大家所熟知，本研究第一次發(fā)現(xiàn)其作為替代稀釋介質(zhì)具有很好的潛能。化學(xué)發(fā)光免疫法的影響因素很多，包括血清中類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig（s）抗體及其他自身抗體、交叉反應(yīng)物、藥物等[18]。近年來，各種干擾因素引起的檢驗結(jié)果假陰性和假陽性的報道[19-20]，越來越受到臨床和相關(guān)衛(wèi)生部門的重視。異嗜性抗體是影響免疫測定結(jié)果的重要因素之一[21]，正常人群中有3%～15%體內(nèi)含有異嗜性抗體 ，而新生牛血清中的動物源性免疫球蛋白可以起到封閉異嗜性抗體的作用[18,22]。牛血清中總蛋白、白蛋白和膽固醇含量的參考范圍與人大致相同[23]，且血清的生產(chǎn)工藝嚴(yán)格，不含雜質(zhì)蛋白，低血紅蛋白含量，抗體和補體量少，防腐措施得當(dāng)[24]。再加上，新生牛血清價格低廉且性能穩(wěn)定，在替代稀釋介質(zhì)中值得被廣泛推廣使用。

總之，在多種替代稀釋介質(zhì)中，新生牛血清在高濃度E2標(biāo)本稀釋中檢測結(jié)果最佳，且穩(wěn)定性好、成本較低、可減小異嗜性抗體的影響，可作為化學(xué)發(fā)光免疫法測定高濃度E2標(biāo)本時的替代稀釋介質(zhì)。