楊明鑫， 魏鴻擎， 謝靜遠(yuǎn)

[1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎臟內(nèi)科，上海200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院腎臟病研究所，上海 200025；3.晶能生物技術(shù)（上海）有限公司，上海 200235]

腎臟疾病的機(jī)制復(fù)雜，部分原因在于腎臟組織具有大量不同的、高度分化的細(xì)胞類型，這為腎臟病機(jī)制研究帶來(lái)困難。傳統(tǒng)的RNA測(cè)序方法，只能獲得所取組織基因表達(dá)的平均水平，無(wú)法獲知單個(gè)細(xì)胞的種類和狀態(tài)，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）可以從單個(gè)細(xì)胞的水平得到基因表達(dá)圖譜，從而對(duì)異質(zhì)性的組織樣本進(jìn)行分群鑒定，在疾病研究中有著很好的應(yīng)用前景，是近年來(lái)發(fā)展很快的一項(xiàng)技術(shù)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以區(qū)分不同的細(xì)胞類型，并了解其基因表達(dá)，為探索腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供思路，該技術(shù)還可以應(yīng)用于腎臟活檢，使得腎臟疾病診療個(gè)體化、精準(zhǔn)化[1]。本文主要介紹現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，及其在腎臟領(lǐng)域中的進(jìn)展和應(yīng)用前景。

scRNA-seq技術(shù)的發(fā)展

一、特定細(xì)胞亞群的基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)

目前的腎臟轉(zhuǎn)錄組研究大多使用表達(dá)譜芯片（microarray）或二代RNA測(cè)序技術(shù)（bulk RNA-seq），檢測(cè)出的基因表達(dá)水平是所有細(xì)胞的平均值。為了分析特定細(xì)胞亞群的基因表達(dá)情況，可以使用細(xì)胞分離技術(shù)，包括顯微分離、熒光細(xì)胞分選技術(shù)、激光顯微切割捕獲技術(shù)等手段進(jìn)行組織分離。如Lee等[2]使用顯微切割的方法得到了大鼠的14個(gè)腎小管節(jié)段，并應(yīng)用二代RNA測(cè)序分析了每個(gè)節(jié)段的基因表達(dá)。Tong等[3]在顯微鏡下分離局灶節(jié)段性腎小球硬化患者的腎小球，進(jìn)行芯片轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)膜金屬內(nèi)肽酶的表達(dá)較對(duì)照組有顯著差異。以上方法可獲得特定組織的基因表達(dá)信息，不過(guò)無(wú)法得到單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄信息。

二、單細(xì)胞分離技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)推動(dòng)scRNA-seq測(cè)序技術(shù)

近十年來(lái)，微流控芯片、微液滴、微孔板技術(shù)，以及使用毛細(xì)管、磁體、電場(chǎng)或沖孔探針自動(dòng)收集細(xì)胞等，為單細(xì)胞分離提供了諸多方法[4]，加上高效的基因擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，使得高通量scRNA-seq成為可能。自2009年Tang等[5]首次應(yīng)用scRNA-seq，2012年Fluidigm公司推出了世界上第一款單細(xì)胞RNA測(cè)序自動(dòng)化系統(tǒng)，其后，單細(xì)胞分離及測(cè)序流程得到了進(jìn)一步改進(jìn)，相關(guān)研究也在如火如荼的進(jìn)行。2017年，多國(guó)科學(xué)家倡議提出的人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃[6]，就是基于scRNA-seq技術(shù)來(lái)構(gòu)建人類的細(xì)胞表達(dá)圖譜。

scRNA-seq主要過(guò)程為，將組織或細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，裂解細(xì)胞、捕獲其中的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)加入單個(gè)細(xì)胞特異的DNA標(biāo)簽，擴(kuò)增cDNA并建立RNA-seq高通量測(cè)序庫(kù)。scRNA-seq的關(guān)鍵步驟在于單細(xì)胞懸液的制備和單細(xì)胞的分離和標(biāo)記。目前的單細(xì)胞分離方法主要有2種，分別是微孔板和微液滴途徑，微孔板途徑可使單個(gè)細(xì)胞分散在單個(gè)微孔中，并加以標(biāo)記；微液滴途徑則是通過(guò)構(gòu)造精細(xì)的微液滴，來(lái)分離識(shí)別單個(gè)細(xì)胞[1]。

1．單細(xì)胞分離途徑

（1）微孔板途徑：微孔板途徑通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞分散到微孔板，再進(jìn)行標(biāo)記和測(cè)序。2012年問(wèn)世的STAT-seq是最早的微孔板方法，其將細(xì)胞分散到96孔板上，反轉(zhuǎn)錄時(shí)在cDNA的一端加入寡核苷酸標(biāo)志物，這樣一次可以測(cè)96個(gè)細(xì)胞。其后，SMART-seq等技術(shù)相繼問(wèn)世。早先的微孔板途徑成本較高，建庫(kù)成本每個(gè)細(xì)胞為5～10美元。隨著技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)luidigm公司開發(fā)了單細(xì)胞捕獲和制備平臺(tái)Fluidigm C1系統(tǒng)，利用微流體芯片分離單細(xì)胞到微孔板，可同時(shí)檢測(cè)800個(gè)細(xì)胞，提高了不同微孔板技術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量。不過(guò)由于該系統(tǒng)的細(xì)胞采集孔為固定大小，對(duì)采集細(xì)胞的大小有偏倚。2017年，改進(jìn)后的STRT-seq-2i技術(shù)使用了9 600微孔陣列平臺(tái)，成本進(jìn)一步降低[7]。微孔板途徑的新方法也不斷涌現(xiàn)，如依靠重力將單個(gè)細(xì)胞沉降在微孔中[8-9]；以及通過(guò)4種標(biāo)記的排列組合，一次標(biāo)記高達(dá)千萬(wàn)數(shù)量級(jí)的細(xì)胞[10]。這些新技術(shù)使得單個(gè)細(xì)胞測(cè)序的成本大大降低，但由于該技術(shù)操作要求高，自動(dòng)化程度低，仍難以推廣。但商業(yè)化的測(cè)序平臺(tái)簡(jiǎn)化了操作流程，如BD公司的BD Rhapsody單細(xì)胞分析系統(tǒng)就是其中代表。

（2）微液滴途徑：微液滴途徑近幾年更為流行，其通過(guò)儀器構(gòu)建復(fù)雜精細(xì)的微液滴，進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分離識(shí)別，可以一次檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。該技術(shù)利用帶有獨(dú)特標(biāo)記的磁珠，與單個(gè)細(xì)胞結(jié)合形成單個(gè)液滴，細(xì)胞裂解后，磁珠上的標(biāo)志物與釋放的mRNA雜交，反轉(zhuǎn)錄成為帶有標(biāo)記的cDNA，之后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。2015年發(fā)布的DropSeq技術(shù)最先采用該方法，實(shí)現(xiàn)了高通量和低成本，但細(xì)胞捕獲率只有大約5%。與DropSeq同時(shí)發(fā)布的InDrops方法則可捕獲60%～90%的細(xì)胞，適用于細(xì)胞數(shù)量少的樣本。隨著商業(yè)化測(cè)序平臺(tái)10×Genomics公司的10×Chromium問(wèn)世，微液滴途徑得到了推廣普及，并且由于其成本低、通量高的特點(diǎn)，成為主流scRNA-seq技術(shù)之一。10×Chromium包括了一整套設(shè)備和試劑，可以快速標(biāo)記100～80 000個(gè)細(xì)胞，捕獲率高達(dá)65%，成本為每個(gè)細(xì)胞0.15~1.00美元。10×Chromium平臺(tái)與上文的BD Rhapsody平臺(tái)不分伯仲，是目前主流的scRNA-seq方法。

二、文庫(kù)構(gòu)建與細(xì)胞識(shí)別

進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需要構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，而建立測(cè)序文庫(kù)的擴(kuò)增方法主要是聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）和體外轉(zhuǎn)錄，PCR的優(yōu)點(diǎn)是速度很快，但屬于非線性擴(kuò)增，即不同的片段擴(kuò)增倍數(shù)不同，且易形成引物二聚體和其他產(chǎn)物；體外轉(zhuǎn)錄則更加嚴(yán)格、準(zhǔn)確，是線性擴(kuò)增，但過(guò)程較慢。UMIs（unique molecular identifier）是在文庫(kù)擴(kuò)增前，用隨機(jī)堿基序列標(biāo)記每個(gè)mRNA片段，在后期分析中可減少PCR的擴(kuò)增偏倚。大部分技術(shù)擴(kuò)增RNA的3′端或者5′端，不能反映全長(zhǎng)，而SMART-seq等技術(shù)則可捕捉RNA的全長(zhǎng)。

三、數(shù)據(jù)分析

scRNA-seq得到的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行多種分析，最常見(jiàn)的是無(wú)監(jiān)督聚類分析，其依照細(xì)胞的基因表達(dá)不同將細(xì)胞分為不同的群體；還可進(jìn)行差異基因篩選分析、基因相互作用、轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)分析、偽時(shí)間排序、分支分析等[1]。由于scRNA-seq技術(shù)打亂了細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)，并不知道測(cè)序細(xì)胞的來(lái)源和位置，數(shù)據(jù)分析時(shí)可根據(jù)特征基因的表達(dá)，判斷細(xì)胞種類和來(lái)源。如Kdr基因可用于識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞，Nphs1和Nphs2基因可識(shí)別足細(xì)胞,Slc12a3基因可識(shí)別遠(yuǎn)曲小管等[11]。

可見(jiàn)，scRNA-seq方法的更新?lián)Q代速度很快，不同方法在測(cè)序通量和質(zhì)量、細(xì)胞大小、處理細(xì)胞數(shù)量等存在不同，需要仔細(xì)考慮方法的適用性和局限性、實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞種類、數(shù)目、不同細(xì)胞的表達(dá)相似程度及測(cè)序成本等，而對(duì)于相似的細(xì)胞類型，可能需要更高分辨率的技術(shù)來(lái)區(qū)分基因表達(dá)差異[12]。

表1 以往研究中腎臟scRNA-seq情況

scRNA-seq技術(shù)在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

目前，scRNA-seq已在細(xì)胞發(fā)育與分化、腫瘤、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等獲得了巨大的進(jìn)展。scRNA-seq技術(shù)在鑒定細(xì)胞亞型、發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞種類，進(jìn)而探究新的分子機(jī)制具有重要作用（見(jiàn)表1）。

一、細(xì)分細(xì)胞亞型

1.小鼠腎組織細(xì)胞RNA表達(dá)研究：scRNA-seq能夠以細(xì)胞為單位構(gòu)建細(xì)胞特異性表達(dá)圖譜，從而發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞間的RNA表達(dá)差異，為探索腎臟發(fā)育及腎臟疾病機(jī)制提供新的方法。如腎臟發(fā)育方面，Brunskill等[13]利用單細(xì)胞捕獲和制備平臺(tái)Fluidigm C1系統(tǒng)對(duì)小鼠早期腎臟進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，建立了腎臟發(fā)育中的細(xì)胞表達(dá)圖譜。而為了探索腎小球細(xì)胞的基因表達(dá)情況，Lu等[14-15]對(duì)腎小球的足細(xì)胞和系膜細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，用磁珠法[16]分離小鼠的腎小球，同樣通過(guò)Fluidigm C1平臺(tái)進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，找到了92個(gè)足細(xì)胞相關(guān)基因，并通過(guò)siRNA沉默對(duì)其中37個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因進(jìn)行功能探究，發(fā)現(xiàn)其大多與足細(xì)胞骨架相關(guān)。不過(guò)可能因?yàn)榧夹g(shù)所限，該研究?jī)H測(cè)了20個(gè)足細(xì)胞。該研究對(duì)系膜細(xì)胞的分析則發(fā)現(xiàn)，既往認(rèn)為特異性表達(dá)于系膜細(xì)胞的基因并非在所有系膜細(xì)胞中均表達(dá)。Chen等[17]使用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)獲取小鼠集合管的主細(xì)胞和閏細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，得到了主細(xì)胞、A型和B型閏細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，建立了集合管基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)。該研究發(fā)現(xiàn)，很多信號(hào)通路的受體和配體分別在集合管的不同細(xì)胞中表達(dá)，如Notch2分子主要在主細(xì)胞表達(dá)，而其配體Jag1主要在閏細(xì)胞中表達(dá)，提示這些細(xì)胞間存在信號(hào)的交互。

既往研究獲得的足細(xì)胞數(shù)量很少，而近年的研究顯示，采用特定方法可以獲得較大數(shù)量的足細(xì)胞[18]。該研究對(duì)8只小鼠的腎臟用磁珠法提取了腎小球[16]，使用DropSeq測(cè)序，獲得了大約13 000個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，其中足細(xì)胞占80%，系膜細(xì)胞占2%，內(nèi)皮細(xì)胞占12%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)消化方式會(huì)影響足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞豐度，而對(duì)腎小管上皮細(xì)胞影響較小。

2.人腎組織scRNA-seq研究：scRNA-seq技術(shù)目前已用于人腎組織，推動(dòng)腎病發(fā)病機(jī)制及腎移植的研究，如能進(jìn)一步應(yīng)用于病理診斷，將有助于建立新的精準(zhǔn)腎臟病理分型。Der等[19]對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎患者的皮膚和腎活檢樣品使用Fluidigm C1進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，在腎小管細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，干擾素誘導(dǎo)相關(guān)的基因與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。有趣的是，在患者的皮膚樣本中亦發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)上調(diào)，提示通過(guò)皮膚等容易獲得的組織進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，可以反映系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎患者腎臟損傷的情況。該研究雖然未能鑒別出足細(xì)胞和系膜細(xì)胞，但首次在人的腎活檢組織中嘗試使用scRNA-seq技術(shù)。近年來(lái)，Wu等[20]對(duì)出現(xiàn)混合型排異反應(yīng)的移植腎活檢組織進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，共測(cè)序了4 487個(gè)細(xì)胞，確認(rèn)了16個(gè)細(xì)胞群，包括腎小管細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和活躍增殖細(xì)胞。研究者發(fā)現(xiàn)，排異反應(yīng)中的內(nèi)皮細(xì)胞根據(jù)基因表達(dá)不同分為3種狀態(tài)——靜息狀態(tài)、血管源性狀態(tài)和免疫球蛋白吞噬狀態(tài)，其中第三種狀態(tài)表達(dá)Fc受體激活通路和抗體內(nèi)化相關(guān)基因，符合抗體介導(dǎo)排異反應(yīng)的病理診斷，將既往發(fā)現(xiàn)的排異反應(yīng)相關(guān)基因精準(zhǔn)定位到了特定細(xì)胞亞群。該研究提示了scRNA-seq檢測(cè)在移植腎活檢中的應(yīng)用潛力，有望建立更精準(zhǔn)的基于細(xì)胞分子分型的腎臟病理診斷體系。

對(duì)腎臟活檢組織進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)目前仍存在挑戰(zhàn)。首先，腎活檢組織比較少，需要更高的細(xì)胞捕獲率；其次是患者腎組織病理類型不能預(yù)先判斷，不易對(duì)特定腎臟病理患者群體行scRNA-seq檢測(cè)。理想狀態(tài)是將腎組織儲(chǔ)存起來(lái)，而不改變細(xì)胞活力或表達(dá)模式，現(xiàn)已有組織保存后行scRNA-seq的報(bào)道。Thomsen等[21]使用一種稱為FRISCR的方法來(lái)固定、染色、分選細(xì)胞，以甲醛固定細(xì)胞，保存在-80℃，并以此方法對(duì)大腦放射狀膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq檢測(cè)。Alles等[22]用甲醇固定細(xì)胞，以人胚腎細(xì)胞和小鼠胚胎細(xì)胞、小鼠神經(jīng)細(xì)胞等為對(duì)象，并證實(shí)其可以保存細(xì)胞數(shù)周，而對(duì)測(cè)得的單細(xì)胞數(shù)據(jù)損失不大。Attar等[23]提出了一種專為scRNA-seq檢測(cè)保存細(xì)胞的方法，通過(guò)使用3，3′-二硫代丙酸二（N-羥基丁二酰亞胺酯）試劑固定保存細(xì)胞，并在慢性髓系白血病細(xì)胞系上應(yīng)用。

二、發(fā)現(xiàn)新的腎臟細(xì)胞種類

應(yīng)用scRNA-seq不僅可以識(shí)別復(fù)雜的腎臟細(xì)胞類型，還可以發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞種類。最近，Park等[11]以10×Chromium系統(tǒng)對(duì)7只成年健康雄性小鼠腎臟進(jìn)行測(cè)序，利用聚類分析將細(xì)胞分為21個(gè)細(xì)胞群，鑒定其中3個(gè)為新的細(xì)胞種類。他們探究了其中一種新的細(xì)胞群，此細(xì)胞群同時(shí)含有主細(xì)胞和閏細(xì)胞的標(biāo)志物，也有獨(dú)特的基因標(biāo)志物如Syt7等，通過(guò)構(gòu)造可以調(diào)控Notch基因表達(dá)的小鼠模型，證實(shí)在成年小鼠中該類細(xì)胞是閏細(xì)胞到主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的中間過(guò)渡形態(tài)，由Notch信號(hào)調(diào)控，研究者將其命名為過(guò)渡細(xì)胞（transitional cell），并進(jìn)一步研究其在疾病中的作用，構(gòu)建了葉酸誘導(dǎo)的CKD小鼠模型，通過(guò)bulk RNA-seq，發(fā)現(xiàn)CKD小鼠的主細(xì)胞表達(dá)增多，而閏細(xì)胞表達(dá)減少，存在閏細(xì)胞向主細(xì)胞轉(zhuǎn)換的趨勢(shì)。對(duì)高血壓、糖尿病性CKD患者的腎活檢組織樣本進(jìn)行bulk RNA-seq分析，亦發(fā)現(xiàn)患者的腎組織存在主細(xì)胞/閏細(xì)胞比例升高。由于閏細(xì)胞與泌酸功能相關(guān)，同時(shí)在葉酸誘導(dǎo)的CKD小鼠模型中觀察到了血漿CO2水平升高，故推測(cè)閏細(xì)胞向主細(xì)胞轉(zhuǎn)換的過(guò)程可能與代謝性酸中毒相關(guān)。除了鑒別新的細(xì)胞，scRNA-seq技術(shù)還可以識(shí)別細(xì)胞的來(lái)源。例如，既往對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞的來(lái)源有爭(zhēng)議，Kramann等[24]采用單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠模型，分離出肌成纖維細(xì)胞，通過(guò)進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腎臟肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)自駐留的周細(xì)胞，少部分來(lái)自循環(huán)來(lái)源的單核細(xì)胞。

問(wèn)題與展望

目前，scRNA-seq面臨諸多挑戰(zhàn)。首先是單個(gè)細(xì)胞RNA量很少，平均每個(gè)細(xì)胞只有10 pg的RNA，僅 0．1 pg為mRNA，需要進(jìn)行高效擴(kuò)增后再測(cè)序。目前的研究報(bào)道，一般每個(gè)細(xì)胞測(cè)得的基因數(shù)目為800個(gè)左右，而大部分細(xì)胞含有5 000～10 000個(gè)基因[12]。其次是單細(xì)胞的分離對(duì)RNA的影響。細(xì)胞的分離采用的消化酶，如胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶等大多在37℃孵育，分離過(guò)程會(huì)使得細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，從而改變部分基因表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟37℃消化15 min后，某些早期即時(shí)反應(yīng)蛋白的表達(dá)量可增高到1 000倍[25]。為了解決該問(wèn)題，可以進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞核的RNA seq檢測(cè)[26-27]，但該方法也有內(nèi)在不足，細(xì)胞核中只有10%～20%的RNA，大部分RNA分布在細(xì)胞質(zhì)中，且細(xì)胞核中也有尚未剪除內(nèi)含子的RNA，使分析變得復(fù)雜。另外，核RNA含量是否能反映細(xì)胞質(zhì)RNA也有爭(zhēng)議。其他減少細(xì)胞分離過(guò)程中應(yīng)激反應(yīng)的辦法還包括使用轉(zhuǎn)錄抑制劑[28]或使用嗜冷菌蛋白酶。如Adam等[25]以嗜冷菌提取的蛋白酶，在6℃對(duì)小鼠腎臟進(jìn)行單細(xì)胞分離，并行scRNA-seq檢測(cè)，與37℃解離細(xì)胞相比，大大減少了測(cè)序失真。

另外，腎臟組織的特殊結(jié)構(gòu)使得腎臟細(xì)胞分離比較困難。如足細(xì)胞通過(guò)足突附著于腎小球毛細(xì)血管，而系膜細(xì)胞更是深埋在腎小球內(nèi)部，難以解離。此外，在解離過(guò)程中部分細(xì)胞容易死亡，導(dǎo)致得到的結(jié)果產(chǎn)生偏倚。因此，腎組織的scRNA-seq檢測(cè)有待細(xì)胞解離方法的進(jìn)展。雖然，scRNA-seq檢測(cè)在腎臟領(lǐng)域應(yīng)用較晚，但相關(guān)研究逐漸增多，使我們能更好地理解腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，并且有潛力替代目前的病理診斷，使腎臟疾病治療個(gè)體化、精準(zhǔn)化。