三種不同品牌ELISA試劑盒檢測ASCA的結(jié)果比較及性能評估

余悠悠， 曾俊祥， 羅 婷， 鄧 琳， 潘秀軍

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092）

炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸（ulcerative colitis，UC）。 近年來我國IBD的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。目前，IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與遺傳、環(huán)境、感染、免疫等因素相關(guān)[2-3]?？贯劸平湍缚贵w（anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA）在國際上已被認(rèn)可是IBD特異性的血清學(xué)抗體之一[4]，其在CD鑒別診斷方面的價值目前也已得到了世界胃腸病學(xué)組織的肯定[5]。在國內(nèi)ASCA也日益得到重視，但國內(nèi)的研究結(jié)果存在很大爭議，尚未達(dá)成共識[6-7]，這給臨床推廣工作帶來一定的障礙。目前，ASCA實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)主要包括間接免疫熒光法（indirect immunofluoescence，IIF）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。本研究選取了市場上3個試劑廠家的ASCA-ELISA試劑盒進(jìn)行臨床樣本的檢測，分析檢測結(jié)果之間的一致性，比較各試劑盒的檢測性能，評估ASCA在IBD診斷和鑒別診斷中的價值，以期為該指標(biāo)的臨床應(yīng)用提供有效參考。

資料與方法

一、資料

1．IBD患者組：140例IBD患者中，CD患者87例，UC患者53例，為2016年6月至2017年11月期間在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科、肛腸外科住院的確診患者，診斷均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012年，廣州）》[6]。

2．疾病對照組（disease control，DC）：DC 組 40 例患者包括急性感染性腸炎、腸息肉、腸結(jié)核、腸易激綜合征等，主訴為均腹痛、腹瀉，后經(jīng)內(nèi)鏡排除IBD。

本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（No．XHEC-D-2017076），所有研究對象均簽署知情同意書。

二、方法

1．血標(biāo)本的采集：經(jīng)患者知情同意后，抽取空腹靜脈血5 mL，置有分離膠的真空管，待室溫凝固后，采用3 000 r/min，常溫離心5 min，分離血清，均放置于-80℃儲存、備用。

2．試劑和方法：ASCA-IgA和ASCA-IgG檢測采用ELISA方法，試劑盒分別采用一家國產(chǎn)品牌試劑A[抗釀酒酵母IgA/IgG抗體定量檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）96人份，山西瑞豪生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號 IBDB16112901、IBDC16112901]；二家進(jìn)口品牌試劑B、C[試劑B為抗釀酒酵母IgA/IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）96人份，美國INOVADiagnostics，Inc．生產(chǎn)， 生產(chǎn)批號 031113、029392；試劑C為抗釀酒酵母IgA/IgG測定試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）96人份，德國EUROIMMUN公司生產(chǎn)；生產(chǎn)批號CE160504AV、CE160504CG]。標(biāo)準(zhǔn)品和陰、陽性質(zhì)控物均采用各試劑盒配套產(chǎn)品，操作步驟嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行檢測，分別根據(jù)各試劑盒說明書提供的臨界值判斷結(jié)果。

3．使用儀器：洗板采用科華ST-36WT全自動洗板機(jī)，在Thermo酶標(biāo)儀上讀取及采集數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；對3種試劑盒檢測的結(jié)果一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，根據(jù)Kappa值定義一致性強(qiáng)弱程度，當(dāng)Kappa＜0，一致性強(qiáng)度極差；0～0．2，微弱；0．21～0．40，弱；0．41～0．60，中度；0．61～0．80，高度；0．81～1．00，極強(qiáng)[8]。 以臨床和（或）病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表分別計算ASCA-IgA、IgG和ASCA-IgA和 （或）IgG診斷IBD的靈敏度、特異度及約登指數(shù)，并采用MedCal Version 15．22進(jìn)行3種試劑盒受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，通過分析曲線下面積（area under curve，AUC）評判各試劑盒的診斷效能。 當(dāng) AUC 接近 0．5 時，表示無診斷價值，AUC＜0．7表示診斷準(zhǔn)確率較低，AUC 在 0．7～0．9表示診斷準(zhǔn)確率中等，AUC＞0．9時表示診斷有較高的準(zhǔn)確率[9]。

表1 3種ELISA試劑盒檢測ASCA的主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)比較

表2 3種試劑檢測ASCA-IgA和（或）ASCA-IgG總陽性率比較[n（%）]

結(jié) 果

一、3種ELISA試劑盒檢測ASCA的主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)比較

列表比較3種ELISA試劑盒檢測的幾項(xiàng)主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)，關(guān)于臨界值的建立，因?yàn)樯袩oASCA的國際參考血清，與國際通用單位之間的關(guān)系并未驗(yàn)證，所以暫無國際標(biāo)準(zhǔn)單位，各試劑盒按自身實(shí)驗(yàn)室結(jié)果設(shè)立（見表1）。

二、3種試劑檢測ASCA-IgA和 （或）ASCA-IgG總陽性率結(jié)果比較

ASCA-IgA和ASCA-IgG兩者有1項(xiàng)結(jié)果陽性或2項(xiàng)同時陽性即作為ASCA-IgA和 （或）ASCAIgG陽性。同一種試劑在CD組中的檢出率均高于UC 組及 DC 組（P＜0．05），而在 UC 組的陽性檢出率與 DC 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。同一組別不同試劑的陽性檢出率情況顯示，3種ELISA試劑在UC組及DC組中陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；而在 CD 組中，試劑 A 與試劑 B 檢測結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而試劑C的陽性檢出率低于試劑 A 及試劑 B（P＜0．05）（見表 2）。

三、3種試劑盒對同一批樣本的檢測結(jié)果一致性評價

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會EP12-2A文件對3種試劑的總樣本檢測結(jié)果作一致性分析，ASCA-IgA兩兩比較的一致性為，試劑A與B、試劑B 與 C、試劑 A 與 C 的 Kappa值分別為 0．423、0．074和0．111，前一組為中等一致性，后2組為極低一致性；3種試劑ASCA-IgG兩兩比較的，試劑A與B、試劑B與C、試劑A與C的Kappa值分別為0．414、0．447 和 0．584，3 組結(jié)果均為中等一致性（見表 3）。

四、3種ELISA試劑檢測ASCA的性能比較

分析評價3種試劑檢測ASCA的結(jié)果對IBD的診斷能力，統(tǒng)計3種試劑盒在ASCA-IgA、ASCAIgG及ASCA-IgA和 （或）ASCA-IgG這3種情況下的靈敏度、特異度以及約登指數(shù)，并采用ROC曲線分析得出各組AUC，評判各試劑盒的診斷準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，3種試劑檢測IgG和IgA抗體時的靈敏度都欠佳，但聯(lián)合檢測2種抗體的靈敏度都高于單項(xiàng)檢測；ASCA-IgA的特異度相對較高，其中試劑C最高為97.5%；ASCA-IgA中試劑A的AUC面積最大為0.72，ASCA-IgG中試劑B的AUC面積最大為0.72,ASCA-IgA和（或）ASCA-IgG的結(jié)果AUC面積最大為試劑B的0.69。結(jié)合以上各項(xiàng)約登指數(shù)，比較3種試劑的檢測性能，試劑盒B綜合效能最佳，試劑盒A次之，試劑盒C較低（見表4、圖1）。

表3 3種試劑盒ASCA-IgA和ASCA-IgG檢測結(jié)果一致性比較

表4 3種試劑盒主要檢測指標(biāo)診斷效能

圖1 ASCA-IgA、ASCA-IgG及ASCA-IgA和（或）ASCA-IgG檢測結(jié)果ROC曲線

討 論

IBD是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括CD和潰瘍性結(jié)腸UC，是北美和歐洲的常見病,但近十余年來本病就診人數(shù)在我國呈逐步增加，趨勢非常明顯，已成為消化系統(tǒng)常見病[1]。IBD的診斷取決于臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡、組織學(xué)、放射學(xué)等，而內(nèi)鏡檢查為侵入性，耗時且有時不被患者接受[10]。特別是在患者的臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡和病理特征不典型或有疑惑時，還可能會出現(xiàn)漏診或誤診現(xiàn)象[9]，這會給個人和社會的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)支出帶來沉重的負(fù)擔(dān)，因此早期診斷并盡早干預(yù)是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[11]，IBD相關(guān)血清生物學(xué)標(biāo)志物的出現(xiàn)有望彌補(bǔ)、甚至部分解決這一問題[12]。

ASCA是國外報道最早的且最具特征性的應(yīng)用于IBD診斷及鑒別診斷的血清學(xué)指標(biāo)之一[10,13]。2010年最新亞太消化學(xué)會炎癥性腸病學(xué)組推出的關(guān)于IBD診斷與治療的共識意見[2]中也將ASCA列為一項(xiàng)鑒別CD與UC的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，每種試劑在CD組中的陽性率都明顯高于UC組及DC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與國外Vermeire等[14]、Herszényi等[15]、國內(nèi)張蜀瀾等[16]的研究結(jié)果相符，表明ELISA檢測ASCA的結(jié)果有利于 UC、CD的鑒別。但同時，該結(jié)果在國內(nèi)仍存在爭議，高翔等[17]的結(jié)果顯示，ASCA檢測陽性率在CD患者僅為11．8%，而UC患者為58．6%。此外，袁柏思等[18]的研究中，ASCA在CD患者中的陽性率也較低，且以上2項(xiàng)研究之間的結(jié)果也不盡一致，與本研究結(jié)果更是大相徑庭。分析發(fā)現(xiàn)，他們皆采用的是間接免疫熒光法檢測ASCA。檢測方法的不同可能是造成這種差異的主要原因。

本文分析3種ELISA試劑盒在各組中檢測的結(jié)果一致性，總體來說ASCA-IgG的一致性較好，ASCA-IgA的一致性不甚理想。分析導(dǎo)致這種差異的原因有以下幾點(diǎn)。①不同生產(chǎn)單位ELISA板的原料、制作工藝不同。②不同廠家抗原的來源，用量及純化方式的差異，或各廠家包被技術(shù)的差異。③抗原本身的復(fù)雜性和可能存在的交叉反應(yīng)。④本文結(jié)果顯示，試劑A與試劑B的一致性較高，而與試劑C的結(jié)果差異較大，試劑盒C酶結(jié)合物使用的是兔抗人抗體，其他2種是羊抗人抗體，考慮可能是酶標(biāo)記抗體的種類不同導(dǎo)致了更大的結(jié)果差異。

有報道稱，ASCA診斷CD的靈敏度和特異度分別為33%和83%，且靈敏度與特異度呈負(fù)相關(guān)[19],本研究則通過靈敏度、特異度、約登指數(shù)和AUC等指標(biāo)來評估3種試劑盒對IBD的鑒別診斷效能，發(fā)現(xiàn)也存在這樣的情況，3種試劑盒單獨(dú)檢測IgA和IgG的靈敏度均較低，特異度相對較高，約登指數(shù)也較低。因此，不推薦將單一抗體指標(biāo)作為IBD的篩查方法，容易漏診，若同時檢測2種抗體,則檢測靈敏度有所提高,有利于IBD的檢出，以試劑B最優(yōu)。就特異度而言，ASCA-IgA的特異度總體優(yōu)于ASCA-IgG，試劑C的ASCA-IgA結(jié)果特異度最高，用于診斷時的誤診率可能較低。ROC曲線結(jié)果顯示，試劑B的各項(xiàng)檢測結(jié)果AUC都較高。因此，綜合來說，試劑B的診斷效能相對較佳，而試劑A作為國產(chǎn)試劑，與進(jìn)口試劑B相比，其主要診斷效能比較接近，填補(bǔ)了國內(nèi)慢性IBD檢測產(chǎn)品的空白，且其更具有價格優(yōu)勢，樹立了國產(chǎn)試劑在自身免疫檢測領(lǐng)域健康快速發(fā)展的信心與驕傲。

總之，3種試劑盒ASCA的ELISA檢測結(jié)果對IBD的陽性診斷價值有限，不適合IBD的人群篩查,但在CD的鑒別診斷方面具有一定的臨床應(yīng)用價值；3種試劑盒各有特點(diǎn)，但檢測結(jié)果尚存在一定的差異；國產(chǎn)試劑在此領(lǐng)域也具有一定的競爭力，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體情況合理選用。