王靜

摘要：1968年建立的鱟試劑內(nèi)毒素檢查法是控制藥品熱原反應(yīng)的重要方法。近年來對內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)功能與作用機(jī)制的不斷深入研究，使需要通過鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢查的品種呈倍數(shù)增加，檢測方法也從定性法發(fā)展到定量法，如何實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程中對藥品內(nèi)毒素水平的定量檢測成為一項(xiàng)重大課題。本文主要闡述了小容量注射劑生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中如何排查和控制細(xì)菌內(nèi)毒素，并記錄了動態(tài)比濁法定量檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更直觀的監(jiān)控生產(chǎn)過程中內(nèi)毒素含量的變化趨勢。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素 鱟試驗(yàn)法 動態(tài)比濁法

【中圖分類號】186.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）02-152-03

1.細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原反應(yīng)

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖成分，在細(xì)菌死亡或自溶后被釋放，作為外源性致熱源作用于中性粒細(xì)胞，使之釋放內(nèi)源性致熱源而引起發(fā)熱，即熱原反應(yīng)。WHO文件中提到，在藥檢范圍內(nèi)控制內(nèi)毒素就是控制熱原。內(nèi)毒素通過消化道時或少量注射入血時不造成機(jī)體損害，若大量入血，可對機(jī)體產(chǎn)生不同程度的致病作用。因此，注射用藥劑、化學(xué)藥品類及醫(yī)療器材類等必須經(jīng)過試驗(yàn)合格后才能使用。

2015年版中國藥典收錄兩種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.細(xì)菌內(nèi)毒素與生產(chǎn)控制

生產(chǎn)小容量注射劑過程中應(yīng)從體系上總體控制內(nèi)毒素水平，對物料、人員、生產(chǎn)環(huán)境、藥品生產(chǎn)過程等進(jìn)行監(jiān)控，了解其初始內(nèi)毒素負(fù)荷，并根據(jù)產(chǎn)品設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)毒素限值，分析生產(chǎn)過程中內(nèi)毒素負(fù)荷，合理設(shè)置內(nèi)毒素監(jiān)測點(diǎn)，制定各監(jiān)測點(diǎn)內(nèi)毒素控制水平，確保產(chǎn)品符合最初設(shè)計(jì)要求。

2.1物料控制

2.1.1注射用水

注射用水排查中應(yīng)至少對配制用水使用點(diǎn)和分配系統(tǒng)中總送、回水口注射用水使用點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，確定注射用水原始內(nèi)毒素負(fù)荷?！吨袊幍洹?015年版中規(guī)定注射用水細(xì)菌內(nèi)毒素限量為每1ml應(yīng)小于0.25EU，濁度法能確定注射用水原始內(nèi)毒素定量值，這對有些內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)要求極為嚴(yán)苛的產(chǎn)品來說尤其重要。

2.1.2一般原輔料

要根據(jù)小容量注射劑產(chǎn)品的限量要求和原輔料的加入量設(shè)置原輔料的內(nèi)毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。目前很多原輔料并沒有設(shè)置內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)，因此，同一種原料生產(chǎn)不同制劑時，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)是不一樣的，非藥典方法設(shè)定的內(nèi)毒素檢查方法應(yīng)進(jìn)行內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證。

2.1.3活性炭

國外目前流行無炭化生產(chǎn)，國內(nèi)一般還采取傳統(tǒng)的加炭吸附除熱原以控制內(nèi)毒素?！吨袊幍洹?015年版規(guī)定，檢查活性炭中所含內(nèi)毒素本底值及活性炭對細(xì)菌內(nèi)毒素吸附力，以確保其原始內(nèi)毒素負(fù)荷和吸附效率，避免因活性炭引入內(nèi)毒素而帶來不良影響。

2.1.4氣體

對小容量注射劑產(chǎn)品使用的壓縮空氣、氮?dú)獾戎苯咏佑|藥品的氣體應(yīng)進(jìn)行終端除菌過濾，在無菌驗(yàn)證合格的基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素取樣檢測，對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素濁度法檢查。

2.1.5包裝容器

小容量注射劑一般采用安瓿或西林瓶包裝，最終的清洗滅菌采用隧道滅菌烘箱，烘箱對細(xì)菌內(nèi)毒素的103挑戰(zhàn)試驗(yàn)應(yīng)在確認(rèn)周期內(nèi)，運(yùn)行中可以記錄和觀察滅菌溫度、運(yùn)行速度，以確保工藝去除內(nèi)毒素的能力。

2.2人員控制

為了維持產(chǎn)品的無菌性，涉及無菌作業(yè)的操作人員在允許進(jìn)入無菌生產(chǎn)區(qū)和進(jìn)行操作前都應(yīng)遵循無菌技術(shù)原則，并進(jìn)行適當(dāng)培訓(xùn)，包括無菌服著裝控制、無菌技術(shù)、潔凈室行為準(zhǔn)則、微生物學(xué)、衛(wèi)生、著裝、無菌操作等；并制定經(jīng)常性培訓(xùn)計(jì)劃定期培訓(xùn)和考核新內(nèi)容。

產(chǎn)品灌封結(jié)束后，應(yīng)對操作人員5指手套進(jìn)行表面微生物取樣檢測，以確認(rèn)是否產(chǎn)生污染。

2.3生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測

根據(jù)GMP2010年的修訂要求，潔凈區(qū)的設(shè)計(jì)必須符合相應(yīng)的潔凈度要求，達(dá)到“靜態(tài)”和“動態(tài)”的標(biāo)準(zhǔn)，評估無菌生產(chǎn)的微生物狀況；無論生產(chǎn)潔凈室何種方式消毒，均需對消毒效果確認(rèn)。

2.4生產(chǎn)過程控制

2.4.1配制

除按工藝要求配制外，還需注意配制灌封系統(tǒng)管道排查是否存在設(shè)計(jì)死角，其清潔及消毒的全過程，藥液及氣體除菌過濾器使用前后的完整性檢查。

對配制藥液取樣：對稀配完成的產(chǎn)品進(jìn)行原始內(nèi)毒素負(fù)荷取樣；對始終灌封藥液取樣。

2.4.2灌封

按照無菌操作的要求進(jìn)行灌裝裝配和藥液灌裝。

對灌封產(chǎn)品取樣：每臺灌封始排藥液的取樣；每臺設(shè)備灌封前中后產(chǎn)品取樣并標(biāo)記。

2.4.3滅菌與檢漏

按滅菌工藝滅菌溫度、時間、裝載方式、裝載量等的要求進(jìn)行滅菌與檢漏。取樣將滅菌前后產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素負(fù)荷對比。

細(xì)菌內(nèi)毒素與比濁法

因一般傳統(tǒng)凝膠法只進(jìn)行內(nèi)毒素限量檢查，無法定量，因此在生產(chǎn)過程中為了解其負(fù)荷情況，采用濁度法對內(nèi)毒素進(jìn)行定量檢查，便于快速準(zhǔn)確地控制內(nèi)毒素污染狀況，提高產(chǎn)品質(zhì)量的可控性。

3.1儀器與試藥

LKM-02-32 型動態(tài)試管檢測儀，小容量注射劑生產(chǎn)過程中樣品（鄭州卓峰制藥有限公司自產(chǎn)）、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、鱟試劑。

3.2方法與結(jié)果

3.2.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和可靠性分析

用BET檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成終濃度分別為2、0.25、0.03EU/ml的內(nèi)毒素溶液，各取0.1ml，分別加到預(yù)先加入0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，每一濃度作3管，同時作陰性對照。以平均反應(yīng)時間的對數(shù)LgT為縱坐標(biāo)，細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度對數(shù)LgC為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：LgT=-0.28711LgC+2.8020，r=-0.9984（絕對值應(yīng)大于0.980），平行管之間的RSD均小于10%，陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度反應(yīng)時間，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果成立。

3.2.2供試品制備及最大有效稀釋倍數(shù)的確定

本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值為1.2EU/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度為0.03EU/ml，供試品的最大有效稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ=2（mg/ml）*1.2（EU/mg）/0.03=80倍。

3.2.3干擾試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的設(shè)置，選擇0.25EU/ml作為靠近曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度，取批號為1801101的樣品，用BET檢查用水將供試品分別稀釋4、8、16、32、80倍，作為供試品溶液1，同時制備含上述供試品并含內(nèi)毒素為λ0.25EU/ml的溶液2，分別取上述溶液各0.1ml，分別加到預(yù)先加入0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，每一濃度作2管。測定結(jié)束后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量，并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率R。

另取批號為2、3的樣品，稀釋8倍制備成溶液A和含相同供試品濃度并含內(nèi)毒素為λ0.25EU/ml的溶液B，依法檢查，結(jié)果B液回收率均在50-200%，符合要求。

3.2.4 對6批產(chǎn)品生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品取樣檢查

在原輔料、注射用水、氣體、生產(chǎn)環(huán)境等排查合格的基礎(chǔ)上，對生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)品取樣，比濁法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果如下。

以上結(jié)果可以看出，采用比濁法對生產(chǎn)過程中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果量化更直觀，除菌過濾工藝雖能去除一部分內(nèi)毒素，但效果不好；該研究產(chǎn)品采用100℃濕熱消毒法，雖不能達(dá)到F0值大于12的嚴(yán)格意義上的滅菌，但加熱法相比除菌過濾法能更有效地降低內(nèi)毒素。

總結(jié)：小容量注射劑對細(xì)菌內(nèi)毒素的控制應(yīng)嚴(yán)格按照GMP的要求，在生產(chǎn)中進(jìn)行全方位動態(tài)化內(nèi)毒素定量控制，了解產(chǎn)品的原始內(nèi)毒素負(fù)荷，生產(chǎn)環(huán)境和人員等過程負(fù)荷狀況等，以確保產(chǎn)品穩(wěn)定性，符合設(shè)計(jì)要求，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

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