徐嘉一 高彥彬 鄒大威 王曉磊 王濤 師一民 吳冰杰
摘要?目的:基于Rho/ROCK信號(hào)通路研究中藥糖腎寧對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型的影響。方法:高糖培養(yǎng)足細(xì)胞,以不同藥物分組干預(yù)足細(xì)胞24 h,用羅丹明染色的鬼筆環(huán)肽法檢測足細(xì)胞骨架,細(xì)胞免疫熒光檢測足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin,Western Blotting檢測RhoA、ROCK1、Nephrin蛋白的表達(dá)。比較不同藥物或藥物濃度對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型的影響。結(jié)果:糖腎寧可改善足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),下調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中異常升高的RhoA和ROCK1蛋白表達(dá),上調(diào)Nephrin表達(dá)。結(jié)論:中藥糖腎寧可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型RhoA/ROCK1信號(hào)通路,減輕足細(xì)胞骨架重構(gòu),改善足細(xì)胞損傷。
關(guān)鍵詞?中藥;糖腎寧;高糖;足細(xì)胞損傷;Rho/ROCK通路;實(shí)驗(yàn)研究;足細(xì)胞標(biāo)志蛋白;糖尿病腎病
Effects of Tangshenning on High Glucose-Induced Podocyte Injury Based on Rho/ROCK Pathway
Xu Jiayi1,2, Gao Yanbin1,2, Zou Dawei1,2, Wang Xiaolei1,2, Wang Tao1,2, Shi Yimin1,2, Wu Bingjie1,2
(1 School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2 Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research, Beijing 100069, China)
Abstract?Objective:To investigate the mechanism of traditional Chinese medicine Tangshenning on high glucose-induced podocyte injury based on Rho/ROCK signal pathway.Methods:Podocytes were cultured in high glucose.The podocytes were treated with different drugs for 24 h.The podocyte cytoskeleton was detected by rhodamine-stained phalloidin.The podocyte marker protein Nephrin was detected by immunofluorescence.Western blotting was used to detect RhoA, ROCK1 and Nephrin protein.Results:Tangshenning could improve the podocyte cytoskeleton, decreased expression of RhoA and ROCK1 protein, and increased expression of high glucose-induced Nephrin expression in high glucose-induced podocyte injury model.Conclusion:Traditional Chinese medicine Tangshenning can reduce the expression of RhoA/ROCK1 signaling pathway-related protein in high glucose cultured podocytes, reduce podocyte cytoskeletal remodeling, increase the expression of high glucose-induced Nephrin protein, and improve high glucose-induced podocyte injury.
Key Words?Traditional Chinese medicine;Tangshenning; High glucose; Podocyte; Rho/ROCK signal pathway;Experimental study; Podocyte marker protein; Diabetic Nephropathy
中圖分類號(hào):R242;R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.014
糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy,DN)是終末期腎病的最常見致病因素,在糖尿病患者中的發(fā)生率高達(dá)30%~40%,是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,也是糖尿病致死的主要因素。DN臨床特征是進(jìn)行性增加的蛋白尿,而足細(xì)胞功能障礙和形態(tài)學(xué)變化均可能導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障功能受損,加重腎小球損傷,導(dǎo)致DN中蛋白尿的產(chǎn)生,足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病腎小球損傷很關(guān)鍵的早期病理標(biāo)記[1-3]。足細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞,由胞體、主突和足突構(gòu)成。足細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一起構(gòu)成腎小球血液濾過屏障,故糖尿病腎病中足突的融合和消失、足細(xì)胞骨架蛋白的缺失、足細(xì)胞數(shù)量改變及裂孔隔膜蛋白異常都將導(dǎo)致足細(xì)胞損傷,進(jìn)一步加劇腎損傷[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排,使足細(xì)胞足突回縮、融合和消失,足細(xì)胞脫落,導(dǎo)致足細(xì)胞形態(tài)和功能改變,加劇腎小球損傷和蛋白尿的產(chǎn)生。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥糖腎寧在改善糖尿病腎病蛋白尿方面有非常顯著的療效[8],而Rho/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)作為治療糖尿病腎病的關(guān)鍵通路,在改善足細(xì)胞損傷和蛋白尿方面至關(guān)重要[9]。本研究將通過Rho/ROCK通路,進(jìn)一步探討糖腎寧改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)道如下。
1?材料與方法
1.1?材料
1.1.1?細(xì)胞與動(dòng)物?小鼠腎小球足細(xì)胞株購自北納創(chuàng)聯(lián)生物公司(批號(hào):BNCC337685);8周齡SPF級SD大鼠,雄性,30只,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào):SCXK(京)2016-0006。倫理編號(hào):AEEI-2017-039。
1.1.2?藥物?糖腎寧(成分:黃芪、金櫻子、大黃、川芎等,購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司),纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司,生產(chǎn)批號(hào):H20040217)。
1.1.3?試劑與儀器?DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco,10567014);0.25%胰蛋白酶溶液(Gibco,25200056);胎牛血清(依科賽,F(xiàn)SP500);Nephrin抗體(Novus);RhoA抗體(proteintech);ROCK1抗體(proteintech);羅丹明-鬼筆環(huán)肽(AAT);甘露醇(Sigma)、葡萄糖(Sigma)。電泳儀和濕轉(zhuǎn)裝置(Bio-Rad,美國);凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(VILBER LOURMAT,法國);正置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國);多功能基因蛋白檢測儀(SpectraMax iD3,奧地利)。
1.2?方法
1.2.1?含藥血清的制備?選取SPF級SD雄性大鼠30只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分空白組和糖腎寧組,糖腎寧組予中藥糖腎寧[20 g/(kg·d)],空白組予生理鹽水,灌胃1次/d(2.25 mL/250 g),連續(xù)灌7 d。末次灌胃1 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,將采集的血液放在4 ℃中靜置過夜,以3 000 r/min,離心15 min,收集上清液,56 ℃水浴30 min滅活,經(jīng)0.22 μm過濾器過濾除菌后,分裝,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2?細(xì)胞培養(yǎng)?取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用胰酶消化細(xì)胞,待細(xì)胞變圓回縮后,立即用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,收集細(xì)胞,1 000 r/min離心3 min,棄上清,加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5 mL于培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2 33 ℃培養(yǎng)箱中增殖,每2 d換液,待細(xì)胞貼壁長至鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右,1∶3傳代。取第4~5代細(xì)胞,放置在5%CO2 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7~14 d后,足細(xì)胞分化成熟,將分化成熟的足細(xì)胞在無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h,進(jìn)行不同分組的干預(yù)24 h。實(shí)驗(yàn)分組為:正常組(NG,L-DMEM培養(yǎng)基+10%空白鼠血清);甘露醇組(MG,L-DMEM培養(yǎng)基+24.5 mmol/L甘露醇+10%空白鼠血清);模型組(HG,30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+10%空白鼠血清);糖腎寧低濃度組(LT,30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+0.4%含藥血清+9.6%空白鼠血清);糖腎寧中濃度組(MT,30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+2%含藥血清+8%空白鼠血清);糖腎寧高濃度組(HT,30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+10%含藥血清);纈沙坦組(XST,30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+1 μmol/L纈沙坦+10%空白鼠血清)。
1.2.3?檢測方法
1.2.3.1?羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架?按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)足細(xì)胞24 h,吸棄舊培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛溶液,常溫固定20 min,再加入PBS溶液稀釋的0.1%rtonX-100孵育10 min,分別加入100 μg/mL的羅丹明-鬼筆環(huán)肽工作液,錫紙覆蓋,常溫孵育1 h,再往每孔中滴加適量DAPI染液,孵育5 min,用抗熒光淬滅封片劑封于載玻片,激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
1.2.3.2?細(xì)胞免疫熒光檢測?按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)足細(xì)胞24 h,用4%多聚甲醛溶液,室溫下固定15 min,再加入PBS溶液稀釋的0.5%Triton X-100,室溫孵育20 min后,向各孔中加入適量的10%正常山羊血清,常溫孵育30 min;吸水紙吸棄封閉山羊血清,不洗,加入稀釋好的一抗,放入濕盒,4 ℃孵育過夜,次日將一抗棄掉,滴加稀釋好的熒光二抗,放入濕盒,于37 ℃孵育1 h后,往各孔中滴加DAPI工作液,避光孵育10 min,用抗熒光淬滅封片劑封于載玻片,在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
1.2.3.3?Western Blot檢測?取分組干預(yù)后的細(xì)胞,加入適量的裂解液,提取細(xì)胞總蛋白,BCA測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液,100 ℃金屬浴加熱10 min變性。吸取20 μg蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)膜至0.45 μm PVDF膜,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h,加入一抗4 ℃孵育過夜,第2天TBST洗膜后加入相應(yīng)的二抗,室溫震蕩1 h,TBST洗膜后加入現(xiàn)配置的ECL發(fā)光液,凝膠化學(xué)發(fā)光成像儀曝光,分析各蛋白表達(dá)水平。
1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2?結(jié)果
2.1?糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響?共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞骨架顯示:NG組細(xì)胞骨架沿細(xì)胞長軸呈線性分布,骨架結(jié)構(gòu)整齊清晰,足突明顯,熒光強(qiáng)度明亮。MG組與NG組相似。而HG組細(xì)胞皺縮,骨架結(jié)構(gòu)斷裂,排列紊亂,熒光強(qiáng)度較NG組表達(dá)明顯暗淡。而LT、MT、HT組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)均明顯改善,熒光強(qiáng)度介于NG組和HG組之間,尤其HT組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)清晰,熒光強(qiáng)度較亮,足突明顯,而XST組細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度亮,骨架結(jié)構(gòu)清楚,但足突不明顯。見圖1。
2.2?糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型Rho/ROCK信號(hào)通路的影響?Western blot結(jié)果顯示,MG組RhoA蛋白表達(dá)較NG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HG組RhoA蛋白表達(dá)較NG組明顯升高(*P<0.05),而LT、MT、HT組和XST組RhoA蛋白表達(dá)較HG組明顯降低(△P<0.05),且LT、MT、HT組呈劑量依賴性下調(diào)異常升高的RhoA蛋白表達(dá)。MG組ROCK1蛋白表達(dá)與NG組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組ROCK1蛋白表達(dá)較NG組明顯升高(*P<0.05),而LT、MT、HT組和XST組ROCK1蛋白表達(dá)較HG組顯著降低(△P<0.05),且LT、MT、HT組呈劑量依賴性下調(diào)異常升高的ROCK1蛋白表達(dá)。見圖2。
2.3?糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型Nephrin蛋白表達(dá)的影響?Western blot結(jié)果顯示,MG組Nephrin蛋白表達(dá)與NG組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組Nephrin蛋白表達(dá)較NG組明顯降低(*P<0.05),而LT、MT、HT組和XST組Nephrin蛋白表達(dá)較HG組明顯升高(△P<0.05),且LT、MT、HT組呈劑量依賴性上調(diào)Nephrin表達(dá)。如圖3,細(xì)胞免疫熒光顯示,足細(xì)胞Nephrin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),呈顆?;蚓€裝分布,NG組和MG組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組Nephrin蛋白表達(dá)量少,LT、MT、HT組Nephrin蛋白表達(dá)較HG組有明顯改善,其中HT組的熒光強(qiáng)度改善最為顯著,XST組Nephrin蛋白表達(dá)較HG組有明顯改善,蛋白表達(dá)趨勢與Western blot結(jié)果一致。見圖3。
3?討論
中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病是“消渴病”遷延日久,病久入絡(luò),繼發(fā)于腎的腎絡(luò)受損疾病,故稱為“消渴病腎病”,國內(nèi)學(xué)者多認(rèn)為本病是以氣陰兩虛為本,痰濕、瘀血、濁毒等為標(biāo)的虛實(shí)夾雜之證。高彥彬教授認(rèn)為腎絡(luò)病變是貫穿糖尿病腎病始終的病理基礎(chǔ),病變早期,腎氣不固,腎絡(luò)瘀滯;病變中期,陰損及陽,脾腎虛衰,腎絡(luò)瘀阻;病變晚期,腎絡(luò)瘀結(jié),腎體勞衰。針對DN早期腎氣不固、腎絡(luò)瘀滯的病機(jī)特點(diǎn),采用益氣固腎,化瘀通絡(luò)法獲得較好療效。臨床研究表明糖腎寧可降低早期糖尿病腎病患者血糖、血脂水平,改善血液流變學(xué),抑制血小板聚集,降低早期DN患者異常升高的肌酐清除率,顯著減少微量蛋白尿,改善腎功能[8]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)糖腎寧可上調(diào)糖尿病大鼠降低的足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白Nephrin,下調(diào)異常升高的足細(xì)胞骨架蛋白Desmin的表達(dá),減少糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷,降低蛋白尿,保護(hù)腎功能[10]。
足細(xì)胞即腎小球上皮細(xì)胞,相鄰足細(xì)胞的足突互相交叉呈指嵌狀形成的裂孔隔膜,與腎小球基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞組成腎小球?yàn)V過屏障。足細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞,在成人腎小球中進(jìn)行細(xì)胞分裂的能力有限,足細(xì)胞肥大、足突融合、足細(xì)胞數(shù)量和密度降低、足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和足細(xì)胞凋亡等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常均會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷,使足細(xì)胞功能喪失,濾過膜通透性增加,進(jìn)而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損,發(fā)生蛋白尿。因此,足細(xì)胞損傷被認(rèn)為是各種腎小球疾病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[11-14]。而足細(xì)胞具有復(fù)雜的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),足細(xì)胞損傷與足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定密切相關(guān),細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對裂孔隔膜和腎小球?yàn)V過屏障至關(guān)重要,足細(xì)胞骨架失調(diào)將直接影響足突,導(dǎo)致足細(xì)胞足突回縮、融合、消失[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組足細(xì)胞足突消失,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)回縮、斷裂,排列紊亂,Nephrin蛋白表達(dá)顯著降低,而糖腎寧可改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重構(gòu),上調(diào)Nephrin蛋白表達(dá),改善足細(xì)胞損傷。
RhoA GTP酶屬于Ras超家族,是一類小GTP酶,可通過結(jié)合GDP和GTP起到分子開關(guān)的作用,Rho與GTP結(jié)合后,可激活下游Rho相關(guān)激酶(ROCK1)發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化。ROCK1是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶,起到調(diào)節(jié)肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞骨架的作用。RhoA激活后,將活化ROCK1,并介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng),增強(qiáng)肌動(dòng)-肌球蛋白收縮,通過控制肌動(dòng)蛋白絲穩(wěn)定、肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)和肌動(dòng)蛋白纖維組裝,誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)[16-20]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平明顯升高,中藥糖腎寧可下調(diào)異常升高的RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平,提示糖腎寧可通過抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路蛋白表達(dá),穩(wěn)定足細(xì)胞骨架調(diào)節(jié),改善足細(xì)胞損傷。
綜上所述,本研究證實(shí)高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞Rho/ROCK信號(hào)通路激活,進(jìn)而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白收縮,以及細(xì)胞骨架重構(gòu),最終導(dǎo)致足細(xì)胞足突融合、消失等足細(xì)胞損傷。中藥糖腎寧可下調(diào)異常升高的RhoA、ROCK1蛋白表達(dá),穩(wěn)定足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),上調(diào)Nephrin蛋白表達(dá),減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。我們認(rèn)為糖腎寧減輕足細(xì)胞損傷的作用可能與抑制Rho/ROCK通路,減輕細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷有關(guān),其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步開展深入研究。
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(2019-06-28收稿?責(zé)任編輯:王楊)