鄭婭 胡生海 何元翔 王佳妮

摘要：以牛背肌肉為原料，篩選Tris-HCl復(fù)合提取液pH、提取液濃度、提取時(shí)間、料液比、硫酸銨溶液飽和度等對(duì)肌紅蛋白提取有影響的因素，并從中選出具有顯著影響的因素（提取液pH、提取液濃度、硫酸銨溶液飽和度）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定牛肉肌紅蛋白提取最優(yōu)工藝參數(shù)提取液pH為8.15、硫酸銨溶液飽和度90.93 %、提取時(shí)間1.63 h。對(duì)粗提蛋白進(jìn)行純化及層析交換分離，得到純度較高的肌紅蛋白含量2.14 mg/mL，總蛋白濃度2.39 mg/mL，樣品純度達(dá)到91.95%。

關(guān)鍵詞：肌紅蛋白;響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn);提取純化

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2019）11-0040-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.11.010

Extracted and Purified Myoglobin in Beef Using

Response Surface Method

ZHENG Ya， HU Shenghai，HE Yuanxiang，WANG Jiani

（Agricultural Products Storage and Processing Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China）

Abstract：In this study， Longissimus dorsi of cattle was used as the material， and the factors of affect the extraction of myoglobin were screened， such as pH value of Tris-HCl composite extracting solution， extract concentration， extracting time， solid-liquid ratio，ammonium sulfate saturation. The factors with significant influence （pH of the extract， concentration of the extract， saturation of ammonium sulfate solution） were selected for response surface optimization test， and the optimal extraction parameters of beef myoglobin were determined： pH value of extracting solution was 8.15， saturation of ammonium sulfate solution was 90.93 %， and extraction time was 1.63 h. The crude protein was dialysis purification and separation by chromatography exchange， to obtain the high purity myoglobin content was 2.14 mg/mL， the total protein concentration was 2.39 mg/mL， and the purity of the sample reached 91.95%.

Key words：Myoglobin;Response surface optimization test;Extraction and purification

作為牛肉制品加工過程中的重要反應(yīng)，脂質(zhì)氧化是影響安全品質(zhì)的主因[1 ]。其中，肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）所介導(dǎo)的脂質(zhì)自動(dòng)氧化是脂質(zhì)氧化的重要途徑。Mb是存在于動(dòng)物肌肉組織細(xì)胞中，貯存并分配氧的色素類蛋白質(zhì)，由1條多肽鏈（珠蛋白，Globin）和1個(gè)血紅素輔基（Hemin）構(gòu)成[2 ]。根據(jù)配位分子的不同，Mb在肌肉中主要以3種形態(tài)存在，即還原型肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、氧合肌紅蛋白（Oxymyoglobin，OxyMb）、高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MetMb）[3 ]。肌肉組織作為一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，不易明確Mb對(duì)肌肉脂質(zhì)的作用，需對(duì)其分離純化后做單項(xiàng)性質(zhì)研究，總體來說，用Tris-HCl緩沖劑提取，并用硫酸銨鹽析，Mb的提取純化效果最好[4 ]。因此，對(duì)牛肉中的肌紅蛋白進(jìn)行提取純化，并保持其還原活性，是進(jìn)一步探索肌紅蛋白性質(zhì)機(jī)理，明確牛肉制品加工環(huán)節(jié)肉質(zhì)成分間相互作用的基礎(chǔ)研究。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

試驗(yàn)原料均取自甘肅祁連牧歌實(shí)業(yè)有限公司。選取5頭健康西門塔爾牛，屠宰后取背最長肌，去除表面脂肪筋腱等異物，液氮冷凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃條件下保存。試驗(yàn)試劑硫酸銨、氯化鈉、甘油、EDTA、二硫蘇糖醇（DTT），均由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所提供;BSA（牛血清蛋白），由上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;考馬斯亮藍(lán)R-250和G-250，由阿拉丁試劑（上海）有限公司提供;三羥甲基氨基甲烷（Tris），由美國Amresco公司提供。

1.2? ?儀器與設(shè)備

TGL-24M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司;SP-756P紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;Sephadex G-75，美國GE公司;PHS-3C pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;JJ-2 高速組織勻漿器，金壇市富華電器有限公司。

1.3? ?試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 肌紅蛋白粗提工藝? ? 參考林森森、吳成帆總結(jié)的方法[5 ]，并稍做修改。取牛肉背最長肌，去除表面筋膜及結(jié)締組織，切碎。準(zhǔn)確稱取一定量肉樣，加入5倍體積提取緩沖劑（10 mmol/L Tris-HCl緩沖液，含1 mmol/L EDTA、0.54 mmol/L甘油、1 mmol/L DTT，4 ℃），10 000 r/s下勻漿1 min，4 ℃下靜置，然后在9 600? r/s下離心10 min（4 ℃），濾紙過濾，得濾液。在濾液中加入固體硫酸銨，一邊加一邊攪拌，至一定飽和度，然后4 ℃下靜置30 min以充分沉淀蛋白質(zhì)。在12 000 r/s、4 ℃下離心30 min，收集沉淀測定樣品吸光度，計(jì)算樣品肌紅蛋白含量及其純度。

1.3.2? ?肌紅蛋白提取工藝優(yōu)化? ? 采用單因素試驗(yàn)，選取提取時(shí)間（A）、pH（B）、提取液濃度（C）、鹽析液飽和度（D）、料液比（E）5個(gè)因素，通過單因素試驗(yàn)確定其對(duì)肌紅蛋白提取量的影響，因子水平見表1。

1.3.3? ? 肌紅蛋白提取Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)? ? 分析上述單因素試驗(yàn)的變化趨勢，利用 Design-expert 8.05軟件，以響應(yīng)值為肌紅蛋白含量，設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)（N=12）。

1.3.4? ? 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)? ? 針對(duì)肌紅蛋白提取工藝，以提高肌紅蛋白含量為目標(biāo)，對(duì)影響肌紅蛋白提取量的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.5? ? 肌紅蛋白提取物透析? ? 經(jīng)鹽析的肌紅蛋白沉淀用2倍體積的Tris-HCl（pH 8.5，10 mmol/L）溶解，置于透析袋中（截留分子量為8k- 14k Da），用相同緩沖液透析24 h，緩沖液置換10次，透析液進(jìn)行磁力攪拌，控制溫度為0～4 ℃。

1.3.6? ?凝膠過濾層析分離提純? ? 選擇 Sephadex G-75作為柱料，將柱子用pH 8.5，1 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡，用0.1 mol/L NaCl溶液（pH 8.4，含有10 mmol/L Tris- HCl）進(jìn)行線性洗脫，流速為2 mL/min，紫外檢測波長為280 nm。

1.3.7? ? 相關(guān)指標(biāo)測定? ? Mb含量測定采用紫外分光光度法，測定Mb溶液在542 nm和700 nm 處的吸光值，重復(fù)3次，取平均值。

Mb含量計(jì)算公式如下：

CMb（mmol/L）=（A542-A700）×2.303，其中Mb是3種衍生型肌紅蛋白總量。

Mb純度的測定：總蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定;標(biāo)準(zhǔn)曲線用0～0.1 mg/mL的牛血清蛋白質(zhì)測定，結(jié)果用mg/mL表示。

Mb純度=（Mb含量/總蛋白質(zhì)含量）×100%

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ?肌紅蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1? ? 提取時(shí)間對(duì)肌紅蛋白含量的影響? ? 由圖1可以看出，肌紅蛋白含量隨著提取時(shí)間延長，在0～1.5 h內(nèi)逐步提高;在提取1.5 h時(shí)含量達(dá)到最大值，為1.63 mg/mL。而后繼續(xù)延長提取時(shí)間，肌紅蛋白含量明顯下降。故在提取時(shí)間為1.0～2.0 h時(shí)，肌紅蛋白含量相對(duì)較高。

2.1.2? ? pH對(duì)肌紅蛋白含量影響? ? 由圖2可以看出，肌紅蛋白含量隨著pH的增大先增加后降低。在pH為8.2時(shí)肌紅蛋白含量達(dá)到最大，為1.62 mg/mL。而后pH繼續(xù)增加，肌紅蛋白含量明顯下降。故在pH為8.0～8.4時(shí)，肌紅蛋白含量相對(duì)較高。

2.1.3? ? 提取液濃度對(duì)肌紅蛋白含量影響? ? 由圖3可以看出，隨著提取液濃度增大，肌紅蛋白含量先增大后減小。在提取液濃度為10.0 mmol/L時(shí)肌紅蛋白含量達(dá)到最大值，為1.61 mg/mL。而后提取液濃度繼續(xù)增加，肌紅蛋白含量明顯下降。故在7.5～12.5 mmol/L時(shí)，肌紅蛋白含量相對(duì)較高。

2.1.4? ? 料液比對(duì)肌紅蛋白含量影響? ? 由圖4可以看出，隨著料液比的增大，肌紅蛋白含量先增大后減小，在料液比為1∶5時(shí)肌紅蛋白含量達(dá)到最大值，為1.62 mg/mL，而后料液比繼續(xù)增加，肌紅蛋白含量明顯下降。由此看出，在料液比為1∶3～1∶7時(shí)，肌紅蛋白含量相對(duì)較高。

2.1.5? ? 硫酸銨飽和度對(duì)肌紅蛋白含量影響

由圖5可以看出，隨著硫酸銨溶液飽和度的增高，肌紅蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。硫酸銨溶液飽和度為90%時(shí)肌紅蛋白含量達(dá)到最大，為1.63 mg/mL。整體來看，在硫酸銨飽和度為85%～95%時(shí)，肌紅蛋白含量相對(duì)較高。

由表2、表3、表4可以得出，Plackett- Burman 試驗(yàn)各因素效應(yīng)的顯著性可確定，5個(gè)因素中能顯著影響肌紅蛋白得率的3個(gè)因素依次為提取時(shí)間（P=0.007 5）、硫酸銨飽和度（P=0.001 6）、提取液pH（P=0.013 4）。從而確定了提取時(shí)間、硫酸銨溶液飽和度、提取pH等3個(gè)因素對(duì)肌紅蛋白提取具有顯著影響。

2.2? ?牛肉肌紅蛋白提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以肌紅蛋白含量為響應(yīng)值，在上述單因素試驗(yàn)范圍內(nèi)，通過 Design-expert 軟件進(jìn)一步完成中心旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果見表5、表6。中心旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表7）表明，模型項(xiàng)P < 0.01，說明肌紅蛋白提取優(yōu)化，所得回歸方程與相關(guān)因素間的關(guān)系極顯著。失擬項(xiàng)P =0.855 6 > 0.05，確定系數(shù)R-Squared與Adj.R-Squared分別為97.45%和94.17%，二者相差不大。另外，對(duì)肌紅蛋白含量結(jié)果預(yù)測進(jìn)行整體估計(jì)，R-Squared和Pred.R-Squared分別為 97.45%和90.12%，說明該模型具有較為合理的擬合度。同時(shí)，提取時(shí)間、pH兩個(gè)因素對(duì)肌紅蛋白含量的影響顯著（P <0.05）;硫酸銨飽和度、提取時(shí)間、pH等3個(gè)因素的二次項(xiàng)、硫酸銨飽和度及其與提取時(shí)間的交互，對(duì)肌紅蛋白含量影響極顯著（P <0.01）。

肌紅蛋白最佳提取參數(shù)通過對(duì)回歸方程求最大值來完成（圖6、圖7、圖8），最大響應(yīng)值 Y（肌紅蛋白含量）達(dá)1.62 mg/mL，此時(shí)對(duì)應(yīng)的因素變量為提取液 pH 8.15、硫酸銨溶液飽和度 90.93 %、提取時(shí)間1.63 h，而后利用預(yù)測所得的最佳提取條件進(jìn)行3次試驗(yàn)，最終所得肌紅蛋白（Mb）平均含量為1.65 mg/mL，總蛋白濃度為9.67 mg/mL。

2.3? ?牛肉肌紅蛋白分離純化

通過圖9看出，經(jīng)粗提取后，所得肌紅蛋白（Mb）平均含量為1.65 mg/mL，總蛋白濃度為9.67 mg/mL;再經(jīng)透析后Mb含量為1.98 mg/mL，總蛋白濃度8.13 mg/mL;最后經(jīng)凝膠過濾層析得到純度較高的Mb樣品，洗脫圖譜顯示，在280 nm處有2個(gè)主吸收峰，第2個(gè)峰吸收值最大，樣品顯示出淺紅棕色，Mb含量為2.14 mg/mL，總蛋白濃度2.39 mg/mL。

3? ?小結(jié)與討論

以牛背肌肉為原料，篩選Tris-HCl復(fù)合提取液pH、提取液濃度、提取時(shí)間、料液比、硫酸銨溶液飽和度對(duì)肌紅蛋白提取有影響的因素，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定牛肉肌紅蛋白提取最優(yōu)工藝參數(shù)為提取液pH 8.15、硫酸銨溶液飽和度90.93%、提取時(shí)間1.63 h。對(duì)牛肌肉中肌紅蛋白進(jìn)行提取分離，粗提取所得肌紅蛋白（Mb）平均含量為1.65 mg/mL，總蛋白濃度為9.67 mg/mL;經(jīng)透析處理后Mb含量為1.98 mg/mL，總蛋白濃度8.13 mg/mL，經(jīng)層析純化后Mb含量為2.14 mg/mL，總蛋白濃度2.39 mg/mL，樣品純度達(dá)到91.95%。

吳成帆試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[6 ]，Mb一次沉淀效果低于分級(jí)沉淀，因此本試驗(yàn)逐步添加硫酸銨固體至溶液中，硫酸銨飽和度達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。同時(shí)，為防止溫度升高導(dǎo)致Mb變性氧化[7 ]，關(guān)鍵試驗(yàn)均在4 ℃條件下進(jìn)行。另外，為保證Mb蛋白活分子鏈之間不會(huì)交聯(lián)，影響提取物得率及還原性[8 ]，在Tris-HCl提取緩沖液加入了甘油、DTT進(jìn)行復(fù)配，結(jié)合透析及凝膠過濾層析，此方法不會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[9 ]，較高純度的肌紅蛋白可有效提升后續(xù)肌紅蛋白性質(zhì)分析、肉質(zhì)成分相互作用等研究內(nèi)容準(zhǔn)確性與科學(xué)性。

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（本文責(zé)編：陳? ? 偉）