蔡莉 許易梅 趙致 劉紅昌 楊繼勇

摘 要：研究金釵石斛不同采收時(shí)間質(zhì)量變化，為其適宜采收期的確定提供依據(jù)。按照2015版《中國(guó)藥典》（一部和四部）測(cè)定不同時(shí)間采收的金釵石斛中的水分、浸出物、總灰分和石斛堿含量，利用比色法、苯酚硫酸法分別測(cè)定黃酮和多糖含量，采用主成分分析法分析不同時(shí)間采收的金釵石斛的質(zhì)量變化并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。兩個(gè)采樣點(diǎn)的金釵石斛水分、總灰分、浸出物和石斛堿含量均在相同時(shí)間達(dá)到最大值，多糖和黃酮含量達(dá)到最大值的時(shí)間不一致;兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛中6個(gè)檢測(cè)指標(biāo)在12個(gè)月均存在顯著差異;兩個(gè)不同采樣點(diǎn)金釵石斛水分含量的變異系數(shù)最小，分別為5.20%和5.73%，多糖含量的變異系數(shù)最大分別為42.35%和34.78%;主成分分析法綜合評(píng)定得出兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛適宜采收期分別為8月至12月和9月至翌年1月，兩個(gè)采樣點(diǎn)最佳采收期為11月。貴州赤水金釵石斛最佳采收期為11月。

關(guān)鍵詞：金釵石斛;主成分分析;采收期

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.23+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）01-0019-05 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.004

金釵石斛（Dendrobium nobiLe LindL.）為天門(mén)冬目蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium.Sw）多年生附生草本植物，以附生在丹霞石上居多[1]。貴州省赤水市因具有適于金釵石斛生長(zhǎng)繁殖的獨(dú)特丹霞地貌，成為金釵石斛道地產(chǎn)區(qū)。金釵石斛含有多糖、黃酮、生物堿等多種活性成分，其中石斛堿是金釵石斛的特征成分[2]。金釵石斛味甘、微咸，具“益胃生津、滋陰清熱”等功效，主用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明等癥[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，金釵石斛還具抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用[4-6]。

生產(chǎn)中，金釵石斛藥材的采收時(shí)間隨意性較大，導(dǎo)致其在中醫(yī)臨床上“方靈藥不靈”的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，確定金釵石斛適宜的采收期以確保其中醫(yī)臨床療效已顯必要。本試驗(yàn)以貴州赤水旺隆鎮(zhèn)鴨嶺村和紅花村金釵石斛種植基地生產(chǎn)的金釵石斛為材料，對(duì)不同采收時(shí)間金釵石斛中的石斛堿、多糖、黃酮、總灰分、浸出物和水分含量進(jìn)行測(cè)定，利用主成分分析法評(píng)價(jià)金釵石斛兩個(gè)不同種植點(diǎn)的藥材質(zhì)量變化，為生產(chǎn)中確定適宜采收期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為金釵石斛兩年生莖稈，于2016年8月至2017年7月采自貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)鴨嶺村和紅花村，其中鴨嶺村海拔（345.307±8）m，紅花村海拔（510.472±12） m，可代表赤水金釵石斛主產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境。采樣時(shí)間為每月25號(hào)，共采集12個(gè)月。樣品為已掉完葉或只剩1～3片葉的莖稈，隨機(jī)采收長(zhǎng)勢(shì)一致的莖稈30枝，重復(fù)三次。除去附著的苔蘚、葉及葉鞘后，切片置于55℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)40目篩于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

萘、石斛堿、無(wú)水葡萄糖和蘆丁對(duì)照品（購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司）、苯酚（購(gòu)自美國(guó)FLuka AnaLyticaL公司）、無(wú)水乙醇、甲醇、甲酸、氫氧化鈉和石油醚均為AR級(jí)。

索氏提取器（SXT-06，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司），超聲清洗器（SG8200HDT，上海冠特聲超聲儀器有限公司），氣相色譜儀（AgiLen7890A t），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo），箱式電阻爐（SX-12-10，天津市泰斯特儀器有限公司），中草藥打粉機(jī)（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（HH-S8，北京科偉永興儀器有限公司），恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-3AB，上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

水分、總灰分、浸出物和石斛堿含量的測(cè)定參照2015版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》一部和四部中的方法 [7-8]。

黃酮含量測(cè)定參考劉璐等[9]的方法有改動(dòng)：

供試品溶液制備：精密稱取樣品0.1 g，置于25 mL干燥具塞試管中，加入20 mL 40%乙醇超聲提取30 min，提取溫度30℃，提取兩次，過(guò)濾，合并濾液，濾液用等體積石油醚萃取3次，置于25 mL容量瓶中用甲醇定容。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁13.55 mg于25 mL容量瓶中用甲醇定容，濃度為0.542 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋10倍，分別吸取稀釋后的蘆丁標(biāo)液0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL置于1.5 mL離心管中，分別加入10 g/L的ALCL3甲醇溶液100 μL，再分別用甲醇溶液補(bǔ)足1000 μL，搖勻，靜置15 min，以不加蘆丁的待測(cè)液為對(duì)照，274 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

供試液測(cè)定：吸取待測(cè)樣品溶液200 μL至1.5 mL離心管中，加入100 μL 10 g/L的ALCL3甲醇溶液，再加入700 μL甲醇溶液，搖勻，靜置15 min，274 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

多糖含量測(cè)定參照羅傲雪等[10]的方法有改動(dòng)：

供試品溶液制備：精密稱取樣品粉末0.25 g，置圓底燒瓶中，加入80%乙醇25 mL，90℃加熱回流提取1 h，趁熱過(guò)濾，用80%熱乙醇以10 mL/次洗滌三次，將濾渣和濾紙置原燒瓶中，加蒸餾水25 mL，100℃回流提取1 h，過(guò)濾，用熱蒸餾水洗滌定容至25 mL，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品1 mg，用蒸餾水溶解定容至500 mL，濃度為200 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取對(duì)照品溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL分別置于1.5 mL的離心管中，各加入蒸餾水至200 μL，分別加入5%的苯酚溶液100 μL，搖勻，分別加入濃硫酸500 μL，迅速搖勻，靜置10 min，40℃水浴1保溫5 min，冷卻至室溫，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值;

供試液測(cè)定：精密吸取供試液20 μL置1.5 mL離心管中，加入蒸餾水180 μL，再加入5%的苯酚溶液100 μL，搖勻，最后加入濃硫酸500 μL，迅速搖勻，靜置10 min，40℃水浴保溫15 min，冷卻至室溫，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用ExceL 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收時(shí)間金釵石斛各檢測(cè)指標(biāo)成分含量變化

不同采收時(shí)間兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛水分、總灰分、浸出物、多糖、黃酮、石斛堿含量見(jiàn)表1、2。

兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛的水分含量在10月達(dá)最高，分別為89.21%和88.31%，在7月最低，分別為75.56%和74.42%;總灰分含量在10月達(dá)最高，分別為4.14%和3.63%，在5月和4月最低，分別為2.31%和2.21%;浸出物含量在3月達(dá)最高，分別為7.10%和6.83%，在10月最低，分別為3.55%和3.20%;鴨嶺樣品多糖含量在6月最高（5.49%），紅花樣品在4月（4.94%），二者最低分別在9月（1.98%）和12月（2.34%）;鴨嶺樣品黃酮含量最高在11月（0.68%）紅花樣品在9月（0.68%），二者最低分別在2月（0.33%）和4月（0.29%）;兩個(gè)采樣點(diǎn)樣品石斛堿含量均在12月達(dá)最高，分別為0.70%和0.64%，最低分別在8月（0.40%）和9月（0.41%）。

兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛10月的水分含量顯著高于2～7月，且7月水分含量均低于其它月份，這與生產(chǎn)地每年7月出現(xiàn)干旱有關(guān);10月的總灰分含量顯著高于2～8月，5月的顯著低于9～12月;3月的浸出物含量顯著高于9～12月，10月的顯著低于除11月的其它月份;鴨嶺村樣品6月的多糖含量顯著高于2、3、8和10～12月，而9月的顯著低于1月和6月，紅花村樣品4月的多糖含量顯著高于9～12月;鴨嶺村樣品各采樣期的黃酮含量差異不顯著，紅花村樣品2月和4月的黃酮含量顯著低于其他月份;鴨嶺村樣品12月的石斛堿含量顯著高于1～5和7～10月，紅花村樣品12月的石斛堿含量顯著高于8～9月。

兩個(gè)采樣點(diǎn)6個(gè)檢測(cè)指標(biāo)成分的變異系數(shù)均為水分<石斛堿<總灰分<浸出物<黃酮<多糖。

2.2 金釵石斛各檢測(cè)指標(biāo)成分的主成分分析

根據(jù)特征值可以確定主成分個(gè)數(shù)，由表3可知，特征合計(jì)大于1的可以定義為主成分，前2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率：鴨嶺村的分別為62.024%、19.295%;紅花村的分別為57.200%、20.782%。當(dāng)主成分個(gè)數(shù)達(dá)到2時(shí)，鴨嶺村的主成分累積貢獻(xiàn)率為81.318%，即2個(gè)主成分代表了鴨嶺村金釵石斛12個(gè)月份金釵石斛各檢測(cè)指標(biāo)81.318%的信息量;當(dāng)主成分個(gè)數(shù)達(dá)到2時(shí)，紅花村的主成分累積貢獻(xiàn)率為77.982%，即2個(gè)主成分代表了紅花村金釵石斛12個(gè)月各檢測(cè)指標(biāo)77.982%的信息量。

由表4可知，兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛的水分、總灰分、黃酮在第一主成分上有較高載荷，石斛堿在第二主成分上有較高載荷，根據(jù)不同成分在各因子上的載荷，可確定水分、總灰分、黃酮、石斛堿為金釵石斛的特征指標(biāo)成分。

用2個(gè)主成分對(duì)兩個(gè)采樣點(diǎn)的金釵石斛進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為，鴨嶺村：F=0.62024×F1+0.19295×F2;紅花村：F=0.57200×F1+0.20782×F2，按綜合評(píng)價(jià)函數(shù)計(jì)算出的兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛各檢測(cè)指標(biāo)的主成分值、綜合成分得分及排序見(jiàn)表5。

在12個(gè)月的樣品中，鴨嶺村排名前五的為11、10、12、8、9月，且這前五名的綜合評(píng)分大于0，說(shuō)明這五個(gè)月份是鴨嶺村適宜采收金釵石斛的時(shí)間;紅花村排名前五的為11、10、12、9、1月，且這前五名的綜合評(píng)分大于0，說(shuō)明這五個(gè)月份是紅花村適宜采收金釵石斛的時(shí)間;鴨嶺村適宜采收金釵石斛的時(shí)間為8～12月，紅花村適宜采收金釵石斛的時(shí)間為9月～翌年1月;兩個(gè)采樣點(diǎn)的最佳采收金釵石斛的時(shí)間均為11月。

3 結(jié)論與討論

兩個(gè)采樣點(diǎn)的金釵石斛水分、總灰分、浸出物和石斛堿含量均在相同時(shí)間達(dá)到最大值，多糖和黃酮含量達(dá)到最大值的時(shí)間不一致;兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛的6個(gè)檢測(cè)指標(biāo)含量在1～12月均存在顯著差異，表明不同采收時(shí)間金釵石斛存在質(zhì)量變化;通過(guò)主成分分析法對(duì)不同采收時(shí)間兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛6個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定兩個(gè)采樣點(diǎn)金釵石斛適宜采收時(shí)間為 11月份，為貴州赤水道地藥材金釵石斛的適宜采收期提供依據(jù)。

根據(jù)主成分分析法對(duì)兩個(gè)采樣點(diǎn)12個(gè)月金釵石斛樣品的綜合評(píng)價(jià)，金釵石斛的生育期紅花村較鴨嶺村晚，由于鴨嶺村海拔為（345.307±8）m，紅花村海拔為（510.472±12）m，表明海拔高度對(duì)金釵石斛的采收期有一定影響，可開(kāi)展進(jìn)一步研究。

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