狼瘡合劑的質(zhì)量控制研究

車(chē)曉平 王天園 王宏 韓旭陽(yáng) 彭冰 曾祖平

摘要目的：建立狼瘡合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：對(duì)狼瘡合劑中淫羊藿、雞血藤、黃芪、白術(shù)進(jìn)行薄層色譜法定性鑒別，對(duì)君藥秦艽含有的龍膽苦苷進(jìn)行高效液相色譜法含量測(cè)定。結(jié)果：薄層色譜圖特征斑點(diǎn)清晰、分離較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾;龍膽苦苷在0.202 5～3.24 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，平均加樣回收率為102.56%，RSD=1.57%（n=6），3批狼瘡合劑中龍膽苦苷平均含量為1.70 mg/mL。結(jié)論：本法準(zhǔn)確、靈敏，重復(fù)性好，為狼瘡合劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞狼瘡合劑;龍膽苦苷;高效液相色譜法;薄層色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R283文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.015

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是自身免疫介導(dǎo)的、累及全身各個(gè)系統(tǒng)，以免疫性炎性反應(yīng)為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病[1]，《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》將系統(tǒng)性紅斑狼瘡分為熱毒熾盛、陰虛內(nèi)熱、瘀熱痹阻、風(fēng)濕熱痹、脾腎陽(yáng)虛、肝腎陰虛、氣血兩虛等7個(gè)證型[2]，中醫(yī)臨床根據(jù)患者病情辨證治療。狼瘡合劑為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由黃芪、秦艽、黨參等11味中藥組成，功效為健脾益腎、活血解毒通絡(luò)，用于脾腎兩虛引起的紅斑狼瘡，有較好的療。

狼瘡合劑的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)黃芪進(jìn)行了薄層色譜鑒別，為了保障臨床用藥的安全性和有效性。本研究采用薄層色譜法建立了雞血藤、白術(shù)、淫羊藿、黃芪的定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)君藥秦艽含有的龍膽苦苷進(jìn)行高效液相色譜法含量測(cè)定。

1材料

1.1儀器GT101高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），H.H.S21.4電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械三廠(chǎng)），XS205電子天平（METTLER TOLEDO），SK7210HP超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），YOKOZS薄層色譜成像儀、YOKOPX噴霧顯色抽氣箱、YOKOPN電動(dòng)噴霧器（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），Agilent 1100高效液相色譜儀（Agilent）。

1.2試劑硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)），0.22 μm微孔濾膜（津騰），所用試劑均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）。

1.3分析樣品狼瘡合劑處方飲片（北京杏林藥業(yè)有限責(zé)任公司）;狼瘡合劑（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院;批號(hào)：20140707、20140708、20140709）;雞血藤對(duì)照藥材（121173200902），白術(shù)對(duì)照藥材（120925200708），龍膽苦苷對(duì)照品（110770201013），淫羊藿苷對(duì)照品（7379203），黃芪甲苷對(duì)照品（7819202），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2方法與結(jié)果

2.1狼瘡合劑中雞血藤、白術(shù)、淫羊藿、黃芪的薄層色譜鑒別[34]

2.1.1雞血藤的薄層色譜鑒別取狼瘡合劑20 mL，每次加入乙醚20 mL振搖提取2次，將乙醚液合并、蒸干，用乙酸乙酯1 mL將殘?jiān)芙?，作為供試品溶液。按狼瘡合劑制備工藝配制無(wú)雞血藤的空白合劑，同法制得不含雞血藤的陰性對(duì)照品溶液。另取雞血藤對(duì)照藥材3 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷后濾過(guò)，所得濾液按供試品溶液制備方法制得雞血藤對(duì)照藥材溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法[6]，分別吸取上述雞血藤陰性對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL、雞血藤對(duì)照藥材溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用展開(kāi)劑正己烷乙酸乙酯甲苯（5∶2∶1）展開(kāi)，取出并晾干，以三氯化鋁溶液噴霧顯色，置365 nm紫外光燈下進(jìn)行檢視。在供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾[5]。見(jiàn)圖1。

2.1.2白術(shù)的薄層色譜鑒別按狼瘡合劑制備工藝配制無(wú)白術(shù)的空白合劑，照2.1.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得不含白術(shù)的陰性對(duì)照品溶液。取白術(shù)對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚20 mL進(jìn)行超聲處理20 min，濾過(guò)后將濾液蒸干，用甲醇2 mL將殘?jiān)芙庾鳛榘仔g(shù)對(duì)照藥材溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法，分別吸取白術(shù)陰性對(duì)照品溶液及2.1.1中供試品溶液各10 μL、白術(shù)對(duì)照藥材溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用展開(kāi)劑正己烷乙酸乙酯甲苯（5∶2∶1）展開(kāi)，取出并晾干，以對(duì)二甲氨基苯甲醛試液噴霧顯色，熱風(fēng)吹干后置365 nm紫外光燈下檢視。在供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾[7]。見(jiàn)圖2。

2.1.3淫羊藿的薄層色譜鑒別將2.1.1中剩余的水層每次用乙酸乙酯20 mL振搖提取2次，將乙酸乙酯液合并蒸干，用甲醇1 mL將殘?jiān)芙?，作為供試品溶液。按狼瘡合劑制備工藝配制無(wú)淫羊藿的空白合劑，照供試品溶液制備方法制得不含淫羊藿的陰性對(duì)照品溶液。另取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg淫羊藿苷的對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法，分別吸取淫羊藿陰性對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL、淫羊藿苷對(duì)照品溶液2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用展開(kāi)劑丁酮甲酸乙酸乙酯水（1∶1∶10∶1）展開(kāi)，取出，晾干，以三氯化鋁試液噴霧顯色，置365 nm紫外光燈下檢視。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾[8]。見(jiàn)圖3。

2.1.4黃芪的薄層色譜鑒別將2.1.3中剩余的水層用水飽和正丁醇振搖提取2次，20 mL/次，合并正丁醇液，依次用氨水、正丁醇飽和水洗滌1次，30 mL/次，蒸干正丁醇液，用甲醇1 mL將殘?jiān)芙?，作為供試品溶液。按狼瘡合劑制備工藝配制無(wú)黃芪的空白合劑，照供試品溶液制備方法制得不含黃芪的陰性對(duì)照品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg黃芪甲苷的對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法，分別吸取黃芪陰性對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL、黃芪甲苷對(duì)照品溶液2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用展開(kāi)劑甲醇三氯甲烷水（7：13：2）的下層溶液展開(kāi)，取出并晾干，以10%硫酸乙醇溶液噴霧，加熱至清晰顯色出斑點(diǎn)。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn);365 nm紫外光燈下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn);陰性樣品均無(wú)干擾[9]。見(jiàn)圖4。

2.2狼瘡合劑中龍膽苦苷的含量測(cè)定[1011]

2.2.1色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱;流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈（90∶10）;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm;柱溫：室溫;流速：1.0 mL/min。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備取龍膽苦苷對(duì)照品20.25 mg精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3陰性對(duì)照品溶液的制備按制劑工藝制備不含秦艽的空白合劑，取5 mL置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，定容，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4供試品溶液的制備精密量取離心后的狼瘡合劑上清液1 mL，置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲5 min，加水定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.5專(zhuān)屬性試驗(yàn)精密吸取秦艽陰性對(duì)照品溶液、龍膽苦苷對(duì)照品溶液與狼瘡合劑供試品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣。龍膽苦苷與其他組分可達(dá)到基線(xiàn)分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖5。

2.2.6線(xiàn)性關(guān)系考察將對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣0.5、1、2、4、6、8 μL，依照2.2.1色譜條件測(cè)定峰面積。以橫坐標(biāo)為龍膽苦苷進(jìn)樣量（X）、縱坐標(biāo)為峰面積積分值（Y）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，獲得龍膽苦苷線(xiàn)性回歸方程Y=1 255.2X1.306 7（r=0.999 99，n=6）。結(jié)果表明，在0.202 5～3.24 μg范圍內(nèi)，龍膽苦苷進(jìn)樣量與峰面積積分值線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.7中間精密度試驗(yàn)取相同供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定龍膽苦苷峰面積積分值，計(jì)算龍膽苦苷含量，結(jié)果RSD為1.37%（n=6），表明所用儀器的精密度良好。

2.2.8供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取相同供試品溶液，在0、2、4、6、8 h每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定龍膽苦苷峰面積積分值，計(jì)算龍膽苦苷含量，結(jié)果RSD=0.89%（n=5），表明龍膽苦苷在供試品溶液中8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9重復(fù)性試驗(yàn)分6次精密吸取相同批號(hào)狼瘡合劑，每次1 mL，按2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定龍膽苦苷峰面積積分值，計(jì)算含量，結(jié)果龍膽苦苷平均含量1.767 mg/mL，RSD=1.23%（n=6），表明龍膽苦苷的含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.10回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的樣品0.5 mL，共6份，置于25 mL量瓶中，分別精密加入濃度為0.405 mg/mL的對(duì)照品溶液3 mL，加水15 mL，超聲5 min，加水定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得供試液。精密吸取供試液10 μL，依法測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果平均回收率為102.56%，RSD=1.57%（n=6）。見(jiàn)表1。

2.2.11耐用性試驗(yàn)選擇2種不同品牌色譜柱，分別為kromasil 1005c18 150 mm×4.6 mm;Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18 2.1 mm ×150 mm，依法測(cè)定同一批號(hào)樣品。結(jié)果表明，使用2種不同品牌的色譜柱，供試品溶液中龍膽苦苷峰均能達(dá)基線(xiàn)分離，分離度符合要求，測(cè)定結(jié)果不受影響，方法耐用性良好。

2.2.12樣品測(cè)定結(jié)果取3批次狼瘡合劑，按2.2.3項(xiàng)下分別制成供試品溶液，依照2.2.1色譜條件每批次進(jìn)樣10 μL測(cè)定龍膽苦苷含量。見(jiàn)表2。

3討論

3.1薄層色譜鑒別對(duì)處方中其他藥味也進(jìn)行了薄層色譜研究。1）鑒別黨參[12]時(shí)，供試液曾經(jīng)嘗試用2.1.4中的供試品溶液、氨水洗滌液部分或正丁醇飽和水洗滌液部分;采用正丁醇冰醋酸水（7∶1∶0.5）、三氯甲烷甲醇水（13∶7∶2）的下層溶液等做展開(kāi)劑。結(jié)果供試品中與黨參炔苷對(duì)應(yīng)位置斑點(diǎn)均不清晰，未收載于正文。2）鑒別拳參[13]時(shí)，以綠原酸、沒(méi)食子酸和拳參藥材作為陽(yáng)性對(duì)照，考察展開(kāi)劑二氯甲烷乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）、乙酸丁酯甲酸水（7∶2.5∶2.5）上層。結(jié)果2.1.3中供試品與綠原酸似有對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，而在與沒(méi)食子酸相應(yīng)位置陰性有干擾。此鑒別特異性不強(qiáng)，未收載于正文。3）鑒別女貞子時(shí)，曾經(jīng)嘗試《中華人民共和國(guó)藥典》收載方法[13]，結(jié)果供試品中與齊墩果酸對(duì)應(yīng)位置無(wú)明顯斑點(diǎn);將女貞子藥材水煎后依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇振搖提取、濃縮后作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果乙酸乙酯部分在二氯甲烷乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）的展開(kāi)條件下，與沒(méi)食子酸相應(yīng)位置陰性有對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，表明二者相互干擾，未收載于正文。4）鑒別丹參時(shí)，考慮制劑的工藝特點(diǎn)，選擇鑒別丹參中的水溶性成分。以2.1.3項(xiàng)下供試液采用藥典方法[13]鑒別丹酚酸B，效果不佳。后參考文獻(xiàn)方法[14]，取丹參藥材1.5 g，加水20 mL，煎煮30 min，放冷，濾過(guò)，濾液用鹽酸調(diào)pH約為2，其余同2.1.3供試品溶液制備，得到丹參對(duì)照藥材溶液;并按處方比例，稱(chēng)取除丹參以外的其他飲片，按成品制備工藝制成空白制劑，再按2.1.3項(xiàng)下供試液制備方法制備，得丹參陰性對(duì)照溶液;以甲苯乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）為展開(kāi)劑、3%三氯化鐵乙醇液為顯色劑，結(jié)果主斑點(diǎn)陰性有干擾。未收載于正文。

3.2含量測(cè)定秦艽既能外散風(fēng)濕舒筋活絡(luò)，又能內(nèi)泄?jié)駸帷鲅苏?，為風(fēng)藥中之潤(rùn)劑，散藥中之補(bǔ)劑，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫中樞系統(tǒng)、保肝、升血糖等廣泛的藥理活性[15]，在狼瘡合劑中為君藥。秦艽中主要有效成分為龍膽苦苷，為《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定的含量測(cè)定成分[13]。

根據(jù)文獻(xiàn)以及藥典中龍膽苦苷的含量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇水（25∶75）、0.1%甲酸乙腈（90∶10）2種流動(dòng)相，使用甲醇水（25∶75）的流動(dòng)相分離效果不好，故舍棄。考察了270 nm、254 nm 2種波長(zhǎng)，比較后得出在波長(zhǎng)270 nm下達(dá)到最大吸收，且分離效果好，陰性無(wú)干擾，故選擇波長(zhǎng)270 nm。

狼瘡合劑的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定方法重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)便易行，為安全有效的用藥提供了一個(gè)合理依據(jù)，可較好地控制狼瘡合劑的質(zhì)量。

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（2016-07-05收稿責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）