黃曉東 周慧華 安健 楊先樂(lè) 曹海鵬
摘要:【目的】明確中華絨螯蟹黑鰓病的病原菌及其藥敏特性,為該病的臨床診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)?!痉椒ā坎捎脗鹘y(tǒng)方法從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺組織中分離病原菌,通過(guò)人工回歸感染試驗(yàn)確定病原菌的致病性,利用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和16S rRNA序列分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定,并以K-B藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定其藥敏特性?!窘Y(jié)果】從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中共分離獲得4株疑似病原菌株(C1、C2、C3和C4),人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明,僅C1菌株感染中華絨螯蟹后出現(xiàn)死亡,死亡率達(dá)90%,且試驗(yàn)中華絨螯蟹出現(xiàn)黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥,與自然發(fā)病的癥狀基本一致。依據(jù)C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析結(jié)果,可確定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii),其對(duì)健康中華絨螯蟹的半數(shù)致死劑量(LD50)為2.85×105 CFU/mL。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,C1菌株對(duì)新霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星等9種抗生素高度敏感,對(duì)多粘菌素B中度敏感,對(duì)氨芐西林、羧芐青霉素和萬(wàn)古霉素3種抗生素已產(chǎn)生耐藥性(不敏感)?!窘Y(jié)論】弗氏檸檬酸桿菌感染可引起中華絨螯蟹黑鰓病,且對(duì)中華絨螯蟹具有較強(qiáng)毒力,實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中可選用新霉素、多西環(huán)素等漁用抗生素進(jìn)行防治。
關(guān)鍵詞: 中華絨螯蟹;黑鰓病;弗氏檸檬酸桿菌;分離鑒定;藥敏特性
0 引言
【研究意義】中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱(chēng)河蟹、大閘蟹,廣泛分布在我國(guó)沿海和湖泊地區(qū),是江蘇、安徽、湖北、浙江和遼寧等地區(qū)的重要特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種(付龍龍等,2017)。近年來(lái),隨著中華絨螯蟹市場(chǎng)需求量的不斷增加,其養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展,年產(chǎn)量已超過(guò)81萬(wàn)t(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局,2017)。但隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖密度及規(guī)模的不斷擴(kuò)大,加上殺蟲(chóng)劑和除藻劑的大量使用,導(dǎo)致其養(yǎng)殖環(huán)境惡化,各種病害頻發(fā),尤其是弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)引起的細(xì)菌性病害給中華絨螯蟹養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(唐玉華和胡賓,2015)。因此,加快中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌的鑒定及藥敏特性檢測(cè),對(duì)確保中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】弗氏檸檬酸桿菌隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)檸檬酸桿菌屬(Citrobacter),可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病,嚴(yán)重制約水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,如紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)暴發(fā)性死亡(沈錦玉等,2005)、施氏鱘(Acipenser schrenckii)腫嘴?。钜票蟮龋?013)、中華鱉(Pelodiscus sinensis)腮腺炎(毛爍君等,2015)、中華絨螯蟹敗血癥(姜光明等,2016)、棘腹蛙(Paa boulengeri)水腫病(李曉英等,2016)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)暴發(fā)性死亡(肖寧等,2016)和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)黑鰓病(馮藝等,2017)等均由弗氏檸檬酸桿菌引起。弗氏檸檬酸桿菌具有鞭毛和菌毛,二者均為細(xì)菌的黏附素,有助于細(xì)菌侵入機(jī)體后黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)定居、繁殖及釋放大量?jī)?nèi)毒素而引起宿主發(fā)病甚至死亡(郭志燕等,2014)。關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹發(fā)病的研究已有報(bào)道,在遼寧(盤(pán)錦)、河北等地養(yǎng)殖的中華絨螯蟹曾先后暴發(fā)過(guò)弗氏檸檬酸桿菌病,但對(duì)比發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)發(fā)生的中華絨螯蟹弗氏檸檬酸桿菌病癥狀完全不同,有的患病中華絨螯蟹表現(xiàn)為肝胰腺、鰓和肌肉輕度水腫,且部分肝胰腺和鰓組織呈腐爛狀(李華等,2001);有的患病中華絨螯蟹則腹腔內(nèi)有積水,其鰓組織呈暗灰色、肝胰腺呈淺黃色(陳翠珍等,2006)。因此,有必要明確弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹發(fā)病但表現(xiàn)出不同臨床癥狀的致病機(jī)理,并制定出科學(xué)的用藥方案及防控措施。【本研究切入點(diǎn)】2017年8月,江蘇省某養(yǎng)殖場(chǎng)的中華絨螯蟹出現(xiàn)嚴(yán)重黑鰓病,具體癥狀表現(xiàn)為病蟹行動(dòng)遲緩,攝食減少或不攝食,鰓呈黑色,肝胰腺呈淺黃色,與已報(bào)道的中華絨螯蟹弗氏檸檬酸桿菌病癥狀(李華等,2001;陳翠珍等,2006;姜光明等,2016)有所不同,因此急需鑒定其病原并科學(xué)用藥以減少經(jīng)濟(jì)損失?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹黑鰓病進(jìn)行病原菌分離鑒定,并采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定其藥敏特性,以期為該病的臨床診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 試驗(yàn)材料
具有典型黑鰓病癥狀的中華絨螯蟹由江蘇省某養(yǎng)殖場(chǎng)提供,平均體重49.8 g/只,共16只;健康中華絨螯蟹由上海崇明某養(yǎng)殖場(chǎng)提供,平均體重28.3 g/只,共150只。藥敏紙片購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和無(wú)菌生理鹽水由國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)(上海海洋大學(xué))自制。
1. 2 病原菌分離
選取具有典型發(fā)病癥狀的瀕死中華絨螯蟹,病蟹以75%酒精表面消毒后無(wú)菌采取其肝胰腺組織,再用無(wú)菌接種環(huán)取樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種,30 ℃恒溫培養(yǎng)18~24 h,待菌落長(zhǎng)出后進(jìn)行菌株純化,最后將純化菌株轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫培養(yǎng)24~48 h后觀察菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色鏡檢,或4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1. 3 人工回歸感染試驗(yàn)
選取無(wú)病傷、體質(zhì)健壯、規(guī)格均勻的健康中華絨螯蟹進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組10只中華絨螯蟹。試驗(yàn)前用無(wú)菌生理鹽水分別洗下?tīng)I(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上的菌落,采用稀釋涂布平板法測(cè)定并以無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度至5.0×106 CFU/mL。試驗(yàn)組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射0.1 mL菌懸液(徐海圣等,2002),對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。養(yǎng)殖水溫28 ℃,試驗(yàn)周期7 d,期間每天記錄試驗(yàn)中華絨螯蟹的死亡數(shù)量,觀察其病癥,及時(shí)撈出死蟹并再次進(jìn)行病原菌分離,確定其致病性。
1. 4 病原菌鑒定
參照Underwood和Avsion(2004)的方法采用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌株進(jìn)行生理生化鑒定,然后參照馮藝等(2017)的方法以16S rRNA序列分析對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。分離菌株的16S rRNA序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析,并通過(guò)鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(肖艷翼等,2015)。
1. 5 病原菌毒力測(cè)定
試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組10只中華絨螯蟹。試驗(yàn)前用無(wú)菌生理鹽水將分離菌株制備成2.0×104~2.0×107 CFU/mL的菌懸液,試驗(yàn)組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射0.1 mL菌懸液(徐海圣等,2002),對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)周期7 d,期間每天記錄試驗(yàn)中華絨螯蟹的死亡數(shù)量,及時(shí)撈出死蟹進(jìn)行病原菌分離鑒定,并根據(jù)概率單位圖解法測(cè)定分離菌株對(duì)中華絨螯蟹的半數(shù)致死劑量(LD50)。
1. 6 病原菌藥敏特性測(cè)定
參照陳永亮等(2015)的K-B藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株的藥敏特性,并根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》判定其對(duì)各種抗生素的敏感度。
2 結(jié)果與分析
2. 1 病原菌分離結(jié)果
從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中共分離獲得4株疑似病原菌株,暫命名為C1、C2、C3和C4。人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明,僅C1菌株感染中華絨螯蟹后出現(xiàn)死亡,死亡率達(dá)90%,且試驗(yàn)中華絨螯蟹出現(xiàn)黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥(圖1),與自然發(fā)病的癥狀基本一致;從人工感染的發(fā)病中華絨螯蟹肝胰腺中可再次分離獲得與C1菌株生理生化特性一致的菌株,因此判定C1菌株是引起中華絨螯蟹黑鰓病的病原菌。C1菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落呈圓形,灰白色,表面光滑濕潤(rùn)、半透明;革蘭氏染色呈陰性,菌體短桿狀(圖2)。
2. 2 病原菌鑒定結(jié)果
采用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)C1菌株進(jìn)行生理生化鑒定,結(jié)果(表2)表明,C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌(C. freundii),其鑒定結(jié)果的可信度為99.3%;與弗氏檸檬酸桿菌參考菌株(楊移斌等,2013)的生理生化特性一致,且C1菌株16S rRNA序列(GenBank登錄號(hào)MK069596)與GenBank中已有弗氏檸檬酸桿菌參考菌株16S rRNA序列的同源性達(dá)99%(表3)。由基于16S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖3)也可看出,C1菌株與弗氏檸檬酸桿菌I-T-1-3株(GenBank登錄號(hào)KU570303)的親緣關(guān)系最近。因此,依據(jù)C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析結(jié)果,可確定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌。
2. 3 病原菌毒力檢測(cè)結(jié)果
以不同濃度(2.0×104~2.0×107 CFU/mL)的菌懸液分別對(duì)健康中華絨螯蟹進(jìn)行注射感染,導(dǎo)致中華絨螯蟹的死亡率達(dá)20%~100%(表4);而注射無(wú)菌生理鹽水的中華絨螯蟹未出現(xiàn)任何病癥及死亡現(xiàn)象,說(shuō)明試驗(yàn)中華絨螯蟹的死亡為C1菌株感染所致。根據(jù)概率單位圖解法建立的死亡概率(y)與懸液菌濃度對(duì)數(shù)(x)關(guān)系曲線方程為y=0.683x+1.274(R2=0.9823),即C1菌株對(duì)健康中華絨螯蟹的LD50為2.85×105 CFU/mL。
2. 4 病原菌的藥敏特性
由表5可知,C1菌株對(duì)新霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星等9種抗生素高度敏感,對(duì)多粘菌素B中度敏感,對(duì)氨芐西林、羧芐青霉素和萬(wàn)古霉素3種抗生素已產(chǎn)生耐藥性(不敏感)。
3 討論
黑鰓病是中華絨螯蟹常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一,其病原菌有氣單胞菌(曹海鵬,2015)、產(chǎn)吲哚黃金桿菌(鄭世雄,2013)等,但關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹黑鰓病的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。弗氏檸檬酸桿菌是一種人—畜—水生動(dòng)物共患致病菌(薛巧等,2015),能產(chǎn)生多種毒力因子,不僅具有蛋白酶活性、溶血活性和形成生物膜的能力,還有鞭毛和菌毛等黏附素,有助于侵入機(jī)體后黏附于細(xì)胞表面形成生物膜,通過(guò)定居、繁殖及釋放大量毒素引起溶血和細(xì)胞壞死,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體損傷(郭志燕等,2014;Heo et al.,2017),說(shuō)明弗氏檸檬酸桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的致病力與這些毒力因子密切相關(guān)。陳紅蓮等(2014)研究表明克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌X120523株的LD50為3.16×107 CFU/mL,馮藝等(2017)研究發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦源弗氏檸檬酸桿菌CF9527株的LD50為1.68×106 CFU/mL。本研究從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中分離獲得1株弗氏檸檬酸桿菌(C1菌株),人工感染健康中華絨螯蟹后表現(xiàn)出黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥,與自然發(fā)病的癥狀基本一致,對(duì)應(yīng)的LD50為2.85×105 CFU/mL,其毒力高于弗氏檸檬酸桿菌X120523株(陳紅蓮等,2014)和CF9527株(馮藝等,2017),可能與弗氏檸檬酸桿菌不同菌株攜帶的毒力因子種類(lèi)和數(shù)量不同有關(guān)。此外,養(yǎng)殖環(huán)境突變可促使中華絨螯蟹產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),消耗大量能量而降低抵抗力(李華等,2001)。因此,弗氏檸檬酸桿菌對(duì)中華絨螯蟹的致病性與養(yǎng)殖環(huán)境惡化也有一定關(guān)系。
弗氏檸檬酸桿菌不同菌株通常也存在理化特性差異。李華等(2001)分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株與陳翠珍等(2006)分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌HQ010516B-1株在肌醇發(fā)酵特性方面存在明顯差異。因此,弗氏檸檬酸桿菌的鑒定需要以生理生化鑒定結(jié)合16S rRNA序列分析為依據(jù)。本研究依據(jù)C1菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析結(jié)果,最終判定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌,即弗氏檸檬酸桿菌可感染引起中華絨螯蟹黑鰓病,且對(duì)中華絨螯蟹具有較強(qiáng)毒力。此外,本研究發(fā)現(xiàn)C1菌株與李華等(2001)分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株在檸檬酸鹽利用、肌醇發(fā)酵等生化特性方面存在差異,與陳翠珍等(2006)分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌HQ010516B-1株在β-半乳糖苷酶、脲酶等生化特性方面存在差異,可能與地區(qū)、氣候和水質(zhì)條件等因素有關(guān)(李小波和黃文芳,2003),但具體原因有待進(jìn)一步探究。
近年來(lái),雖然基于中藥、益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技術(shù)研究取得顯著進(jìn)展,但由于這些抗生素替代品尚存在應(yīng)用效果不穩(wěn)定、成本較高、基礎(chǔ)理論研究不完善等問(wèn)題(王熙濤等,2015),因此,合理使用和選擇有效抗生素仍是防控細(xì)菌性疾病的主要手段。本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,C1菌株對(duì)多西環(huán)素、新霉素和恩諾沙星等漁用抗生素高度敏感,可作為防治中華絨螯蟹黑鰓病的首選藥物;但C1菌株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的敏感性與中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株(李華等,2001)和HQ010516B-1株(陳翠珍等,2006)存在差異,說(shuō)明中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌不同菌株間也存在藥敏特性差異。因此,臨床用藥時(shí)必須依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果有針對(duì)性地選擇最有效的藥物進(jìn)行治療,以減輕病原菌的耐藥性和提高病害防控效果。C1菌株對(duì)氨芐西林和羧芐青霉素等青霉素類(lèi)抗生素已產(chǎn)生耐藥性,與陳翠珍等(2006)、Heo等(2017)對(duì)弗氏檸檬酸桿菌耐藥性的研究結(jié)果相同,可能與弗氏檸檬酸桿菌普遍攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因有關(guān)(吳榮輝等,2013)。
4 結(jié)論
弗氏檸檬酸桿菌感染可引起中華絨螯蟹黑鰓病,且對(duì)中華絨螯蟹具有較強(qiáng)毒力,實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中可選用新霉素、多西環(huán)素等漁用抗生素進(jìn)行防治。
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(責(zé)任編輯 蘭宗寶)