吳堅?鄭賡唐?張琳?唐忠慶?王嵐?蘇勝紅?陳昶

【摘要】 目的 探討多囊卵巢綜合征（PCOS） 卵巢顆粒細胞凋亡基因Bcl-2、Bax、p53的表達及意義。方法 選擇35例行腹腔鏡下雙側(cè)卵巢打孔術(shù)的PCOS患者（PCOS組），另選擇同期30例行腹腔鏡婦科手術(shù)的非PCOS患者（對照組），收集術(shù)中取得的卵巢組織，通過免疫組織化學(xué)染色法檢測2組卵巢顆粒細胞凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax、p53分布與表達，計算組織學(xué)積分，比較PCOS患者術(shù)前及術(shù)后的卵泡刺激素、黃體生成素（LH）、雌二醇、睪酮水平，PCOS組患者術(shù)后規(guī)律服用二甲雙胍1 500 mg/d，對其進行為期1年的隨訪，對比Bax陽性與Bax陰性患者的1年臨床妊娠率差異。結(jié)果 PCOS組患者的術(shù)后LH、睪酮均低于術(shù)前（P均< 0.05）。PCOS組的Bax陽性顆粒細胞主要見于囊性卵泡壁，對照組Bax陽性顆粒細胞較少，散在分布于卵巢上皮間質(zhì)。2組的Bcl-2陽性顆粒細胞數(shù)量均較少。PCOS組的p53陽性細胞主要散在分布于小卵泡壁，對照組的p53陽性細胞多為散在分布。PCOS組的Bax及p53蛋白的組織學(xué)積分均高于對照組（P均< 0.05），2組Bcl-2蛋白的組織學(xué)積分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。35例PCOS患者中，Bax陽性28例、陰性7例，術(shù)后隨訪1年，Bax陽性者的1年臨床妊娠率高于Bax陰性者（P < 0.05）。結(jié)論 凋亡調(diào)控蛋白Bax、p53可能參與PCOS患者卵巢顆粒細胞的凋亡。

【關(guān)鍵詞】 細胞凋亡;多囊卵巢綜合征;腹腔鏡手術(shù);妊娠

Expression and significance of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in ovarian granulosa cells of patients with polycystic ovary syndrome Wu Jian， Zheng Baotang， Zhang Lin， Tang Zhongqing， Wang Lan， Su Shenghong， Chen Yan. Department of Gynecology， Wuzhou Workers’ Hospital， the Seventh Affili-ated Hospital of Guangxi Medical University，Wuzhou 543001， China

Corresponding author， Wu Jian， E-mail： wjnzc0625@ 126. com

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in the ovarian granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome （PCOS）. ?Methods Thirty-five PCOS patients undergoing laparoscopic bilateral ovarian drilling （PCOS group） and 30 non-PCOS patients who underwent laparoscopic gynecologic surgery （control group） were recruited in this investigation. Ovarian tissues were collected during the operation. The distribution pattern and expression level of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in the ovarian granulosa cells were detected by immunohistochemical staining in two groups， and the histological grading scores were calculated. The levels of follicle stimulating hormone， luteinizing hormone （LH）， estradiol and tesosterone of PCOS patients were quantitatively measured and compared before and after operation. Patients in the PCOS group were given with metformin at a dose of 1 500 mg/d postoperatively and followed up for 1 year. The 1-year clinical pregnancy rate was statistically compared between patients with positive and negative Bax. Results The postoperative LH and testosterone levels in the PCOS group were significantly lower than those before operation （both P < 0.05）. In the PCOS group， the Bax-positive granulosa cells were mainly distributed in the cystic follicular wall， whereas the quantity of Bax-positive granulosa cells was small and scattered in the ovarian epithelial stroma in the control group. The number of granulosa cells with positive Bcl-2 was small in both groups. In the PCOS group， p53-positive granulosa cells were mainly scattered in the wall of small follicles， whereas those in the control group were scattered. The histological grading scores of Bax and p53 proteins in the PCOS group were significantly higher than those in the control group （both P < 0.05）， whereas the histological score of Bcl-2 protein did not significantly differ between two groups （P > 0.05）. Among 35 PCOS patients， Bax was positive in 28 cases and negative in 7 cases. During 1-year follow-up， the 1-year clinical pregnancy rate of Bax-positive patients was significantly higher compared with that of those with negative Bax （P < 0.05）. ?Conclusion Bax is probably involved in the apoptosis of ovarian granulosa cells in PCOS patients.

【Key words】 Cell apoptosis;Polycystic ovary syndrome;Laparoscopic surgery;Pregnancy

多囊卵巢綜合征（PCOS）是以稀發(fā)排卵或無排卵、高雄激素或胰島素抵抗、多囊卵巢為特征的內(nèi)分泌紊亂癥候群，臨床表現(xiàn)包括月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、慢性無排卵、不孕、多毛及痤瘡等[1]。PCOS患者因持續(xù)無排卵，嚴(yán)重情況下會使子宮內(nèi)膜過度增生，增加罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險[2]。在女性卵巢中，每個月有多個卵泡發(fā)育，但僅有1個優(yōu)勢卵泡，其余卵泡閉鎖，這是通過顆粒細胞凋亡機制實現(xiàn)[3]。Das等[4]報道，PCOS患者卵巢顆粒細胞可能存在不正常的細胞凋亡調(diào)控而引起PCOS。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如細胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用。Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細胞色素C的釋放，具有促凋亡作用。p53可以上調(diào)Bax的表達水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用。腹腔鏡下雙側(cè)卵巢打孔術(shù)主要用于對氯米芬抵抗PCOS患者的治療，二甲雙胍可降低雄激素水平，利于卵泡發(fā)育[5]。本研究收集對氯米芬抵抗PCOS患者卵巢打孔術(shù)取得的卵巢組織，檢測顆粒細胞的凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax、p53分布與表達，并與非PCOS患者的卵巢組織作對比，對PCOS者予二甲雙胍治療，隨訪觀察Bax陽性者與陰性者的1年臨床妊娠率，分析PCOS卵巢顆粒細胞凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax、p53的表達及其意義。

對象與方法

一、研究對象

收集2009至2016年在我院行腹腔鏡下卵巢打孔術(shù)的35例PCOS患者作為PCOS組，患者年齡22 ～ 38歲、中位年齡26歲，不孕年限1 ～ 4年、中位不孕年限2年，原發(fā)性不孕26例、繼發(fā)性不孕9例。35例PCOS患者均符合2003年鹿特丹會議PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者丈夫行精液常規(guī)檢查未見異常，術(shù)前經(jīng)子宮輸卵管造影術(shù)排除輸卵管阻塞，經(jīng)氟米芬促排卵治療3 ～ 6個療程及螺內(nèi)酯降雄激素治療均未妊娠。另收集同期在我院因良性卵巢囊腫或子宮肌瘤行腹腔鏡下卵巢囊腫或肌瘤剝離術(shù)的30例非PCOS患者作為對照組，患者年齡25 ～ 39歲、中位年齡28歲，術(shù)前3個月內(nèi)未使用任何激素類藥物，并于卵泡期手術(shù)。所有病例均排除庫欣綜合征、分泌雄激素的腫瘤、先天性腎上腺皮質(zhì)增生。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入組者均簽署知情同意書。

二、方 法

1. 標(biāo)本染色

收集2組患者術(shù)中取得的卵巢石蠟包埋組織塊，重新進行4 μm 厚連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶連接（SP）法行免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）。Bcl-2、Bax、p53一抗及SP免疫組化試劑盒均為丹麥Dako公司產(chǎn)品，購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，按試劑盒說明書要求操作。

2. 免疫組化半定量分析

由2位副高或以上職稱病理科醫(yī)師采用雙盲法評價免疫組化結(jié)果，在電子顯微鏡400倍視野下計數(shù)切片內(nèi)所有顆粒細胞和免疫組化陽性的顆粒細胞，計算同一染色強度的陽性顆粒細胞數(shù)占顆粒細胞總數(shù)的百分比（pi），并對染色強度（i）進行評分：細胞漿內(nèi)無棕色顆粒出現(xiàn)為0分，細胞漿內(nèi)有較淺的棕色顆粒出現(xiàn)為1分，細胞漿內(nèi)有清晰棕色顆粒出現(xiàn)為2分，細胞漿內(nèi)有明顯棕色顆粒出現(xiàn)為3分。組織學(xué)積分=Σpi （i+1），其中“1”為糾正系數(shù)，組織學(xué)積分最高為4，以組織學(xué)積分>3分為陽性，反之為陰性[6]。

3. 觀察內(nèi)容

收集2組患者的年齡、不孕年限等一般資料，以及PCOS組術(shù)前及術(shù)后首次月經(jīng)第2 ～ 5 d的卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇、睪酮等臨床資料，PCOS組患者術(shù)后規(guī)律服用二甲雙胍1 500 mg/d，對其進行為期1年的隨訪，對比Bax陽性與Bax陰性患者的1年臨床妊娠率差異。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 處理數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計量資料以表示，組內(nèi)腹腔鏡術(shù)前術(shù)后比較采用配對t檢驗，組間比較采用成組t檢驗;非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組內(nèi)腹腔鏡術(shù)前術(shù)后比較采用符號秩和檢驗。計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、35例PCOS患者在腹腔鏡術(shù)前、術(shù)后的FSH、LH、雌二醇及睪酮比較

PCOS組患者的FSH、雌二醇在腹腔鏡術(shù)前、術(shù)后比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），術(shù)后LH、睪酮均低于術(shù)前（P均 < 0.05）。

二、PCOS組與對照組卵巢組織切片的Bcl-2、Bax和p53免疫組化結(jié)果比較

1. 鏡下所見

PCOS組的Bax陽性顆粒細胞主要見于囊性卵泡壁，呈小片狀分布（圖1A），卵巢上皮間質(zhì)也有少量散在分布。對照組Bax陽性顆粒細胞較少，散在分布于卵巢上皮間質(zhì)（圖1B）。2組的Bcl-2陽性顆粒細胞數(shù)量均較少，PCOS組主要見于囊性卵泡壁（圖1C）。PCOS組的p53陽性顆粒細胞主要散在分布于小卵泡壁（圖1D），對照組的p53陽性顆粒細胞多為散在分布（圖1E）。

2. 定量分析

PCOS組的Bax及p53蛋白的組織學(xué)積分均高于對照組（P均< 0.05），2組Bcl-2蛋白的組織學(xué)積分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

三、PCOS患者中Bax陽性者與Bax陰性者的1年臨床妊娠率比較

35例PCOS患者中，Bax陽性28例、陰性7例。術(shù)后隨訪1年，18例（51%）成功妊娠，其中Bax陽性17例、陰性1例。Bax陽性者的1年臨床妊娠率為61%，Bax陰性者的1年臨床妊娠率為1/7。Bax陽性者的1年臨床妊娠率高于Bax陰性者（P = 0.041）。

討 論

隨著腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展及普及，對于有手術(shù)指征及不愿應(yīng)用促性腺激素的氯米芬抵抗PCOS患者，可行腹腔鏡下雙側(cè)卵巢打孔術(shù)。研究顯示，腹腔鏡下卵巢打孔術(shù)可改善PCOS月經(jīng)周期，改善卵巢局部異常的因素，降低卵巢的張力，打開增厚的卵巢包膜，改善卵巢的微循環(huán)，從而誘導(dǎo)自發(fā)排卵[5]。PCOS以無排卵和高雄激素血癥為特征。一般認為，LH偏高與內(nèi)分泌紊亂有關(guān)，而LH偏高可能導(dǎo)致卵巢功能失調(diào)，卵泡難以成熟和破裂[7]。本研究顯示，腹腔鏡雙側(cè)卵巢打孔術(shù)后PCOS患者的睪酮有所下降，提示患者的高雄激素血癥有一定程度的改善。

Dell’Aquila等[8]報道，顆粒細胞的凋亡率過高會影響卵母細胞的成熟，并起到重要的作用。有學(xué)者認為，顆粒細胞發(fā)生大量凋亡，則影響睪酮轉(zhuǎn)化雌激素，導(dǎo)致雄性激素升高，而在高雄激素的作用下，PCOS患者的卵泡發(fā)育出現(xiàn)停滯[9]。本研究通過腹腔鏡手術(shù)進行卵巢活檢，結(jié)果顯示 PCOS組Bax、p53組織學(xué)積分高于對照組，提示促凋亡蛋白Bax、p53異常升高可能促進顆粒細胞凋亡。PCOS患者的顆粒細胞凋亡與妊娠相關(guān)，顆粒細胞的凋亡率增加會導(dǎo)致不孕，其凋亡率高，則妊娠率低[9]。本研究中，2組卵巢組織顆粒細胞抑凋亡蛋白Bcl-2陽性顆粒細胞少而表達低，提示凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2/Bax之間失衡對顆粒細胞凋亡有影響[8]。二甲雙胍是改善PCOS胰島素抵抗的常用藥物[10]。動物實驗顯示，二甲雙胍通過增加PCOS大鼠卵巢顆粒細胞 中Bcl-2的表達及下調(diào)Bax的表達，抑制顆粒細胞凋亡，從而促進PCOS大鼠的排卵[11]。本研究對PCOS組35例患者經(jīng)腹腔鏡手術(shù)治療后予口服二甲雙胍治療，1年內(nèi)有16例患者自然妊娠，1年臨床妊娠率為61%，其中Bax陽性者的1年臨床妊娠率高于Bax陰性者。限于本研究中p53陽性者例數(shù)較少，無法分析p53陽性對臨床妊娠率的影響，這有待日后加大樣本量完善研究結(jié)果。

綜上所述，凋亡調(diào)控蛋白Bax、p53可能參與PCOS患者卵巢顆粒細胞的凋亡。腹腔鏡下雙側(cè)卵巢打孔術(shù)治療PCOS可有效降低患者體內(nèi)雄激素及LH水平，術(shù)后卵巢組織活檢若顆粒細胞的凋亡調(diào)控蛋白染色明顯異常，需加強藥物治療，以提高PCOS患者的妊娠成功率。

參 考 文 獻

[1] 陳莉莉. 自擬加味桂枝茯苓湯在多囊卵巢綜合征患者中的臨床療效觀察. 新醫(yī)學(xué)， 2014， 45（8）： 547-550.

[2] Harris HR， Terry KL. Polycystic ovary syndrome and risk of endometrial， ovarian， and breast cancer： a systematic review. Fertil Res Pract，2016，2：14.

[3] Mikaeili S， Rashidi BH， Safa M， Najafi A， Sobhani A， Asadi E， Abbasi M. Altered FoxO3 expression and apoptosis in granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome. Arch Gynecol Obstet，2016，294（1）：185-192.

[4] Das M， Djahanbakhch O， Hacihanefioglu B， Saridogan E， Ikram M， Ghali L， Raveendran M， Storey A. Granulosa cell survival and proliferation are altered in polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab， 2008， 93（3）：881-887.

[5] 周彩云.腹腔鏡下卵巢打孔術(shù)聯(lián)合二甲雙胍治療難治性多囊卵巢綜合征不孕療效觀察.實用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2017，17（5）：81-82.

[6] 劉潤俠，劉艷巧.補腎活血方對子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者子宮內(nèi)膜的影響.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（6）：14-15.

[7] 楊建輝，徐秀燕，李秀英. 來曲唑?qū)Χ嗄衣殉簿C合征患者促排卵的臨床初步探討.新醫(yī)學(xué) ， 2009， 40（3）： 173-175.

[8] Dell’Aquila ME， Albrizio M， Maritato F， Minoia P， Hinrichs K. Meiotic competence of equine oocytes and pronucleus formation after intracytoplasmic sperm injection （ICSI） as related to granulosa cell apoptosis. Biol Reprod，2003，68（6）：2065-2072.

[9] 孫春玲，喬杰，陳英玉， 張婷，胡振興.體外受精-胚胎移植中多囊卵巢綜合征顆粒細胞凋亡與妊娠結(jié)局關(guān)系的探討.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，23（9）：695-697.

[10] 張二紅，黎小妍，徐芬，張?zhí)硭?，古? 二甲雙胍改善多囊卵巢綜合征大鼠胰島素敏感性的機制. 中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）， 2014， 35（6）：839-844.

[11] 范從紅，李根，廖曉燕， 辜定釬，曹麗麗.二甲雙胍對多囊卵巢綜合征大鼠排卵及卵巢顆粒細胞中B淋巴細胞瘤-2和兔抗人單克隆抗體表達的影響.中國婦幼保健，2017，32（24）： 6277-6281.

（收稿日期：2018-08-29）

（本文編輯：林燕薇）