黃霜?陳素琴

【摘要】 Crouzon綜合征是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性顱縫早閉癥，其致病基因是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（FGFR2）基因。該文收集1例顱面部發(fā)育異常男性患兒的臨床資料并進(jìn)行綜合分析;提取患兒及其父母的外周血DNA，采用PCR擴(kuò)增FGFR2基因的全部18個(gè)外顯子及剪接位點(diǎn)序列，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。結(jié)果顯示，患兒攜帶了FGFR2 c.1024T>C（p.Cys342Arg）突變，患兒的雙親該位點(diǎn)均為正常的T堿基。FGFR2基因突變?cè)谠摷蚁抵斜憩F(xiàn)為新發(fā)突變;但不排除患兒雙親之一為該突變的生殖系嵌合體。該例檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了p.Cys342Arg為FGFR2基因的突變，p.Cys342Arg突變可引起Crouzon綜合征。

【關(guān)鍵詞】 Crouzon綜合征;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2;基因突變

Genetic analysis of FGFR2 gene mutation in a child with Crouzon syndrome Huang Shuang， Chen Suqin. Department of Laboratory， Panyu Hexian Memorial Hospital， Guangzhou 510530， China

Correspondence author， Chen Suqin， E-mail： chensq@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】 Crouzon syndrome is a rare dominantly inherited disorder characterized by craniosynostosis， and the pathogenic gene is the fibroblast growth factor receptor 2 （FGFR2） gene. In this paper， the clinical data of a Chinese boy with craniofacial malformation were collected and comprehensively analyzed. The DNA sampling was extracted from the peripheral blood of the affected child and his parents. All 18 exons and the intron-exon splice sites of FGFR2 gene were amplified by polymerase chain reaction （PCR）. The results showed that the patient carried a heterozygous mutation c.1024T>C（p.Cys342Arg）in the FGFR2 gene. Both of the parents showed the normal T at the same nucleotide. FGFR2 gene mutation was present as de novo mutation. However， the possibility of one of his parents carrying the chimera of this gene mutation could not be excluded. The detection results confirmed that p.Cys342Arg was the hotspot mutation in FGFR2 gene， which accounted for Crouzon syndrome.

【Key words】 Crouzon syndrome;Fibroblast growth factor receptor 2;Gene mutation

Crouzon綜合征（MIM 123500）是一種罕見(jiàn)的先天性遺傳病，是由于顱骨冠狀縫過(guò)早骨化閉合而引起的顱面部發(fā)育異常。其臨床主要表現(xiàn)為顱縫過(guò)早閉合、顱面部發(fā)育不良、眼球突出、眼眶淺、眼距寬、外斜視、鷹鉤鼻、上唇短、上頜縮小、下頜前突等，患者通常四肢發(fā)育正常[1]。63% 的病例會(huì)出現(xiàn)顱內(nèi)高壓，隨顱壓增高，可出現(xiàn)不同程度的智力低下[2]。該病由法國(guó)神經(jīng)病學(xué)家 Octave Crouzon于1912年首次報(bào)道，呈常染色體顯性遺傳，發(fā)病率約為16.5/1 000 000[3]。其致病基因是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（ FGFR2， MIM 176943），位于10q26.13，編碼FGFR2蛋白（NP_000132.3）基因，屬酪氨酸激酶受體家族成員，在物種進(jìn)化中氨基酸序列高度保守[4]。目前全世界已發(fā)現(xiàn)的引起Crouzon綜合征的FGFR2基因的致病性突變有51種以上（http：//www.hgmd.cf.ac.uk）。筆者對(duì)1例Crouzon綜合征患兒進(jìn)行FGFR2基因的突變分析，旨在查明該病的遺傳學(xué)病因。

病例資料

一、病史及相關(guān)檢查

患兒男，8歲，足月順產(chǎn)第1胎。出生體質(zhì)量3 000 g，生后即發(fā)現(xiàn)患兒面容特殊，臨床擬診為“顱面部發(fā)育不良”。患兒父母要求“行遺傳學(xué)分析”，遂于2018年6月26日到中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室檢查。該家庭來(lái)自廣東，漢族。父母健康，非近親婚配，雙方家系中均無(wú)遺傳病史。

體格檢查：發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)良好，生命體征正常。舟狀頭，眼距寬，眼球突出，眼眶淺，外斜視，鷹鉤鼻，上唇短，上頜縮小，下頜前突。一側(cè)外耳道閉鎖，上下齒呈反咬合，牙齒排列不齊。智力發(fā)育未見(jiàn)明顯遲緩。四肢發(fā)育未見(jiàn)異常。其他系統(tǒng)未見(jiàn)明顯異常。

影像學(xué)檢查：出生6個(gè)月時(shí)頭部MRI平掃顯示：頭顱呈方形，雙側(cè)側(cè)腦室體部及前角略大，顱內(nèi)未見(jiàn)異常信號(hào)影，顱內(nèi)腦質(zhì)形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，腦髓鞘化與月齡相符;腦室、腦池形態(tài)、大小正常、中線結(jié)構(gòu)未見(jiàn)移位;腦溝和腦裂未見(jiàn)異常;顱骨未見(jiàn)異常信號(hào)影;雙側(cè)眼球突出。1歲時(shí)頭顱螺旋CT掃描+三維顯示：雙側(cè)腦室、第三腦室稍擴(kuò)張;顱骨呈方形改變，前囟未閉;頜面骨及雙側(cè)顴弓稍狹小、塌陷。2歲時(shí)頭顱CT掃描顯示：雙側(cè)腦室、第三腦室稍擴(kuò)張;顱骨呈方形改變，前囟未閉（較前稍有發(fā)育）;頜面骨及雙側(cè)顴弓稍狹小、塌陷。6歲時(shí)顱腦多層螺旋CT平掃顯示：腦實(shí)質(zhì)未見(jiàn)明顯異常密度灶;腦室系統(tǒng)無(wú)變形;腦溝、腦池?zé)o增寬;中線結(jié)構(gòu)居中無(wú)移位;顱骨骨質(zhì)連續(xù)性無(wú)中斷;雙側(cè)上頜竇黏膜增厚，提示上頜竇炎癥。

二、遺傳學(xué)分析

經(jīng)患兒家屬知情同意，并經(jīng)中山大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，取患兒及其父母外周血2 ml，按常規(guī)酚/氯仿/異戊醇抽提法抽提基因組DNA。

對(duì)患兒及其父母的FGFR2基因的全部18個(gè)外顯子及其剪接位點(diǎn)進(jìn)行直接序列分析。根據(jù)NM_000141.4序列，從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome.ucsc.edu）中獲取人類FGFR2基因的DNA序列。以在線軟件Primer3（http：//frodo.wi.mit.edu/）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為30 μl，含1×PCR Buffer、4 種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各20 mmol/L、氯化鎂2.5 mmol/L，上游和下游引物各0.33 μmol/L、Taq DNA聚合酶（MBI）1.5 U， 基因組DNA約0.1 ～ 0.7μg。熱循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s、60 ℃退火45 s、72 ℃

延伸1 min 30 s，共35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、回收純化，并直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromos Lite 2.1.1軟件（Technelysium公司）進(jìn)行分析，所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的FGFR2基因序列進(jìn)行比對(duì)。變異位點(diǎn)的描述按人類基因組變異協(xié)會(huì)所推薦的命名法則（http：//varnomen.hgvs.org/），即+1位為NM_000141.4中轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG中的A[5]。

測(cè)序結(jié)果顯示，患兒FGFR2基因第8外顯子存在突變c.1024T>C（p.Cys342Arg），使第342位密碼子TGC變?yōu)镃GC，導(dǎo)致正常的半胱氨酸（C）變?yōu)榫彼幔≧），即p.Cys342Arg錯(cuò)義突變?；純旱母赣H、母親該位點(diǎn)均為正常的T堿基，見(jiàn)圖1。患兒被診斷為顱型Crouzon綜合征。

討 論

顱縫早閉癥是由于顱縫過(guò)早閉合引起的先天性異常，一般分為非綜合征型和綜合征型，其中后者除了顱縫早閉外，還伴有身體其他部位的畸形，如面部、大腦、四肢畸形，甚至出現(xiàn)顱內(nèi)壓升高、腦發(fā)育遲緩、癲癇發(fā)作等[6]。Crouzon綜合征是顱縫早閉癥中最常見(jiàn)的一種，占所有顱縫早閉癥的4.8%。顱縫早閉的順序和范圍影響了畸形的嚴(yán)重程度。顱縫最早可在出生前或圍產(chǎn)期融合，也可發(fā)生于嬰兒期和兒童期。顱縫融合過(guò)程開(kāi)始得越早，對(duì)兒童顱骨生長(zhǎng)發(fā)育的影響越大[7]。根據(jù)患兒不同程度的顏面畸形，Crouzon綜合征可分為5種類型：①上頜型，以中面部的后縮、凹陷為主要特征;②假性型，主要變現(xiàn)為突眼畸形;③顏面型，有典型的突眼、中面部后縮和反頜畸形;④顱型，除顏面型的特征外，還有短頭、頜竇發(fā)育不良等癥狀;⑤顱面型，所有癥狀均可出現(xiàn)，并有明顯的顱內(nèi)壓升高、眶距增寬等伴隨癥狀[8]。另外，還存在一種特殊的出生后才表現(xiàn)的Crouzon綜合征亞型，即患者出生時(shí)顱縫無(wú)明顯閉合，但出生后數(shù)月或數(shù)年隨顱縫進(jìn)行性閉合而出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。本研究中患兒出生時(shí)即出現(xiàn)明顯癥狀，主要表現(xiàn)為突眼、中面部發(fā)育不良及反頜畸形，屬于顱型Crouzon綜合征。

FGFR2基因是Crouzon綜合征的致病基因，其編碼產(chǎn)物FGFR2蛋白（NP_000132.3），屬于FGFR家族成員[9]。FGFR具有4個(gè)結(jié)構(gòu)類似的成員：FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，分別由4個(gè)獨(dú)立的基因編碼，均屬酪氨酸激酶受體。FGFR2是一種跨膜蛋白，主要由3部分組成：胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)為配體結(jié)合區(qū)，由3 個(gè)典型的免疫球蛋白樣（Ig-like）結(jié)構(gòu)域（IgⅠ、IgⅡ、IgⅢ）和IgⅠ、IgⅡ間的酸性區(qū)構(gòu)成。FGFR2 的IgⅢ的mRNA 可以選擇性剪接，從而形成不同亞型的受體。FGFR結(jié)合配體的特異性取決于IgⅢ。IgⅢ的N-端由外顯子Ⅲa編碼，C-端由外顯子Ⅲb或者Ⅲc編碼，產(chǎn)生FGFR2b和FGFR2c兩種亞型的蛋白。FGFR2b主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，F(xiàn)GFR2c主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。FGFR2與多個(gè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）配體結(jié)合，參與FGF的信號(hào)傳遞，在骨縫形成和肢芽發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。FGFR2基因的表達(dá)異常與骨骼系統(tǒng)疾病、關(guān)節(jié)炎和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān);其中與腫瘤相關(guān)的疾病包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、胃癌、食管癌、膽管癌和膀胱癌等[11]。

迄今全世界已發(fā)現(xiàn)的FGFR2基因突變約159種（http：//www.hgmd.cf.ac.uk，HGMD Professional 2019. 1版本）。FGFR2 基因突變與至少9種不同的臨床綜合征有關(guān)，包括Crouzon 綜合征、Pfeiffer綜合征、Apert綜合征、Jackson-Weiss綜合征、Beare-Stevenson Cutis Gyrata綜合征、Saethre-Chotzen綜合

征、Lacrimo-auriculo-dento-digital等。其中導(dǎo)致Crouzon綜合征的突變類型最多，超過(guò)51種;其余依次是Pfeiffer 綜合征（27種）、其他顱縫早閉癥（11種）、Apert綜合征（9種）、Jackson-Weiss綜合征（6種）。Crouzon綜合征與其他顱縫早閉綜合征的主要區(qū)別在于患者四肢發(fā)育正常;而Pfeiffer綜合征伴有短粗、彎曲的大拇指和大腳趾，Apert綜合征伴有手足并指/趾畸形（又稱“尖頭并指/ 趾畸形”），Jackson-Weiss綜合征伴有足部畸形。95%引起Crouzon綜合征的突變集中在Ⅲa和Ⅲc。本研究患兒的c.1024T>C（p.Cys342Arg）突變位于FGFR2基因的第8外顯子（NM_000141.4），編碼FGFR2蛋白IgⅢ的C-端Ⅲc區(qū)。p.C342是該基因突變的熱點(diǎn)，可發(fā)生各種氨基酸替代：Cys342Arg、Cys342Gly、Cys342Ser、Cys342Trp、Cys342Phe和Cys342Tyr[12-17]。Cys342是該外顯子唯一的半胱氨酸，該氨基酸形成的二硫鍵對(duì)維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)GFR2基因中半胱氨酸的替代是Crouzon綜合征的主要原因[18]。半胱氨酸的替代，形成了異常的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，徹底改變了蛋白質(zhì)的終產(chǎn)物。突變蛋白的酪氨酸激酶活性增強(qiáng)，產(chǎn)生不依賴配體刺激的系統(tǒng)[19]。有趣的是，Cys342的不同突變可表現(xiàn)為不同的綜合征，甚至同一突變可表現(xiàn)為不同的綜合征，如與本研究中患者相同的Cys342Arg突變，可導(dǎo)致Crouzon綜合征、Pfeiffer綜合征和Jackson-Weiss綜合征[13-14， 16， 19]。這反映了修飾基因或表觀遺傳在決定疾病的最終表型中起了一定的作用[20]。

Crouzon綜合征患者30% ～ 60%為散發(fā)病例，

表現(xiàn)為新發(fā)突變。Glaser等[21]通過(guò)分子遺傳學(xué)分析證實(shí)了部分散發(fā)病例的突變來(lái)自父源，認(rèn)為Crouzon綜合征與父本的年齡效應(yīng)有關(guān)，即父親年齡越大，更易攜帶生殖系突變。研究顯示，攜帶FGFR2功能獲得性突變的精原細(xì)胞受到了正向選擇作用而更有生存優(yōu)勢(shì)，也有學(xué)者（Goriely等，2010年）發(fā)現(xiàn)有些散發(fā)病例的突變來(lái)自生殖系嵌合體的母親。本研究中患兒的雙親均未攜帶相同的突變，表現(xiàn)為新發(fā)突變;患兒的父親婚育年齡并不大（為30歲），不支持Crouzon綜合征與父本的年齡效應(yīng)有關(guān)的假說(shuō);但不排除患兒雙親之一為該突變的生殖系嵌合體。

Crouzon綜合征目前尚無(wú)有效根治方法;部分患者可通過(guò)手術(shù)進(jìn)行重塑矯正來(lái)改善畸形和緩解癥狀，但部分患者伴有不同程度的智力低下[8]。因此，攜帶者的檢出及開(kāi)展產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前基因診斷，對(duì)于防止Crouzon綜合征重癥患兒的出生、改善人口素質(zhì)，具有重要的意義。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Robin NH， Falk MJ， Haldeman-Englert CR. FGFR-related Craniosynostosis syndromes. In： Adam MP， Ardinger HH， Pagon RA， Wallace SE， Bean LJH， Stephens K， Amemiya A， editors. GeneReviews? [Internet]. Seattle （WA）： University of Washington， Seattle; 1993-2019. Available from http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1455/

[2] Abu-Sittah GS， Jeelani O， Dunaway D， Hayward R. Raised intracranial pressure in Crouzon syndrome： incidence， causes， and management. J Neurosurg Pediatr，2016; 17（4）：469-475.

[3] Al-Namnam NM， Hariri F， Thong MK， Rahman ZA. Crouzon syndrome： genetic and intervention review. J Oral Biol Craniofac Res，2019，9（1）：37-39.

[4] Reardon W， Winter RM， Rutland P， Pulleyn LJ， Jones BM， Malcolm S. Mutations in the fibroblast growth factor receptor 2 gene cause Crouzon syndrome. Nat Genet，1994，8（1）：98-103.

[5] den Dunnen JT， Dalgleish R， Maglott DR， Hart RK， Greenblatt MS， McGowan-Jordan J， Roux AF， Smith T， Antonarakis SE， Taschner PE. HGVS recommendations for the description of sequence variants： 2016 update. Hum Mutat，2016，37（6）：564-569.

[6] Wang JC， Nagy L， Demke JC. Syndromic Craniosynostosis. Facial Plast Surg Clin North Am，2016，24（4）：531-543.

[7] 王世玉，呂長(zhǎng)勝. Crouzon綜合征的診斷及治療進(jìn)展.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)， 2012，21（7）：1273-1277.

[8] Mathijssen IM. Guideline for care of patients with the diagnoses of Craniosynostosis： Working Group on Craniosynostosis. J Craniofac Surg，2015，26（6）：1735-1807.

[9] Azoury SC， Reddy S， Shukla V， Deng CX. Fibroblast growth factor receptor 2 （FGFR2） mutation related syndromic Crani-osynostosis. Int J Biol Sci，2017，13（12）：1479-1488.

[10] Moosa S， Wollnik B. Altered FGF signalling in congenital crani-ofacial and skeletal disorders. Semin Cell Dev Biol，2016，53：115-125.

[11] Tuzon CT， Rigueur D， Merrill AE. Nuclear fibroblast growth factor receptor signaling in skeletal development and disease. Curr Osteoporos Rep，2019，17（3）：138-146.

[12] Ke R， Yang X， Tianyi C， Ge M， Lei J， Mu X. The C342R mutation in FGFR2 causes Crouzon syndrome with elbow deformity. J Craniofac Surg，2015，26（2）：584-586.

[13] Paumard-Hernández B， Berges-Soria J， Barroso E， Rivera-Pedroza CI， Pérez-Carrizosa V， Benito-Sanz S， López-Messa E， Santos F， García-Recuero II， Romance A， Ballesta-Martínez JM， López-González V， Campos-Barros á， Cruz J， Guillén-Navarro E， Sánchez Del Pozo J， Lapunzina P， García-Mi?aur S， Heath KE. Expanding the mutation spectrum in 182 Spanish probands with Craniosynostosis： identification and characterization of novel TCF12 variants. Eur J Hum Genet，2015，23（7）：907-914.

[14] Tartaglia M， Di Rocco C， Lajeunie E， Valeri S， Velardi F， Battaglia PA. Jackson-Weiss syndrome： identification of two novel FGFR2 missense mutations shared with Crouzon and Pfeiffer craniosynostotic disorders. Hum Genet，1997，101（1）：47-50.

[15] Ma HW， Lajeunie E， Le Merrer M， de Parseval N， Serville F， Weissenbach J， Munnich A， Renier D. No evidence of genetic heterogeneity in Crouzon craniofacial dysostosis. Hum Genet，1995，96（6）：731-735.

[16] Meyers GA， Day D， Goldberg R， Daentl DL， Przylepa KA， Abrams LJ， Graham JM Jr， Feingold M， Moeschler JB， Rawnsley E， Scott AF， Jabs EW. FGFR2 exon IIIa and IIIc mutations in Crouzon， Jackson-Weiss， and Pfeiffer syndromes： evidence for missense changes， insertions， and a deletion due to alternative RNA splicing. Am J Hum Genet，1996，58（3）：491-498.

[17] Lin Y， Gao H， Ai S， Eswarakumar JVP， Zhu Y， Chen C， Li T， Liu B， Jiang H， Liu Y， Li Y， Wu Q， Li H， Liang X， Jin C， Huang X， Lu L. FGFR2 mutations and associated clinical observations in two Chinese patients with Crouzon syndrome. Mol Med Rep，2017，16（5）：5841-5846.

[18] Steinberger D， Mulliken JB， Müller U. Predisposition for cysteine substitutions in the immunoglobulin-like chain of FGFR2 in Crouzon syndrome. Hum Genet，1995，96（1）：113-115.

[19] Park WJ， Meyers GA， Li X， Theda C， Day D， Orlow SJ， Jones MC， Jabs EW. Novel FGFR2 mutations in Crouzon and Jackson-Weiss syndromes show allelic heterogeneity and phenotypic variability. Hum Mol Genet，1995，4（7）：1229-1233.

[20] Helman SN， Badhey A， Kadakia S， Myers E. Revisiting Crouzon syndrome： reviewing the background and management of a multifaceted disease. Oral Maxillofac Surg，2014，18（4）：373-379.

[21] Glaser RL， Jiang W， Boyadjiev SA， Tran AK， Zachary AA， Van Maldergem L， Johnson D， Walsh S， Oldridge M， Wall SA， Wilkie AO， Jabs EW. Paternal origin of FGFR2 mutations in sporadic cases of Crouzon syndrome and Pfeiffer syndrome. Am J Hum Genet，2000，66（3）：768-777.

（收稿日期：2019-01-30）

（本文編輯：洪悅民）