申建梅　汪超　鐘宏新　胡黎明

摘要：【目的】分析斜紋夜蛾蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因（SlitPDI）的序列特征和發(fā)育表達(dá)模式，為解析SlitPDI蛋白在斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理功能提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎肈NASTAR對(duì)SlitPDI基因序列特征和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究SlitPDI基因在斜紋夜蛾2齡、4齡、6齡幼蟲及蛹和新羽化雌、雄成蟲共6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】SlitPDI基因編碼494個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該蛋白分子量約55.3 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.52。氨基酸序列分析結(jié)果表明，SlitPDI蛋白序列具有PDI家族的典型特征：在序列的N端及C端均具有二硫鍵/巰基氧化還原位點(diǎn)-CGHC-。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，SlitPDI蛋白與意大利蜜蜂（Apis mellifera）的PDI蛋白序列一致性最低，為50.2%;與家蠶（Bombyx mori）的PDI蛋白序列一致性最高，為83.4%。斜紋夜蛾不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，SlitPDI基因在4齡幼蟲中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量是基準(zhǔn)含量2齡幼蟲的1.27倍;在剛羽化雌、雄成蟲的表達(dá)量也較高，分別為基準(zhǔn)含量2齡幼蟲的1.03和1.12倍?！窘Y(jié)論】SlitPDI蛋白屬于I類PDI家族蛋白，SlitPDI基因在斜紋夜蛾4齡幼蟲和新羽化成蟲中的表達(dá)量相對(duì)較高。

關(guān)鍵詞： 斜紋夜蛾;二硫鍵異構(gòu)酶;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;表達(dá)模式

圖文分類號(hào)： S433.4;Q966 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）05-0996-05

Abstract：【Objective】The sequence characteristics and developmental expression patterns of Spodoptera litura protein disulfide isomerase（SlitPDI） were analyzed to provide reference for the study of the physiological function of SlitPDI protein during S. litura growth. 【Method】The sequence characteristics and evolutionary relationship of SlitPDI gene was analyzed by DNAstar software. The relative expression levels of SlitPDI gene in the stages of the 2nd， 4th， 6th instar larvae， pupa， newly emerged male and female adults were investigated by real-time fluorescence quantitative PCR method. 【Result】The SlitPDI gene encoded 494 amino acids with an estimated molecular mass of 55.3 kD， and the theoretical isoelectric point（pI） was 4.52. Amino acid sequence analysis showed that the SlitPDI protein sequence had the typical characteristics of the PDI protein family： it had disulfide bond/sulfhydryl reduction-oxidation site CGHC at the N-terminus and C-terminus of the sequence. Phylogenetic analysis indicated that SlitPDI protein had the lowest sequence identity（50.2%） with the PDI protein sequence of Apis mellifera， and it had the highest sequence identity（83.4%） with the PDI protein sequence of Bombyx mori. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression level of SlitPDI in the 4th instar larva reached the highest peak， and the amount was as 1.27 times as that in the 2nd instar larva. The expressions of the newly emerged male and female larvae were also high， which were as 1.03 and 1.12 times as that in the 2nd instar larva respectively. 【Conclusion】The SlitPDI protein belongs to the class I PDI family protein， and the SlitPDI gene is expressed relatively high in the 4th instar larvae and newly emerged adults of S. litura.

Key words： Spodoptera litura; disulfide isomerase; real-time fluorescence quantitative PCR; expression pattern

0 引言

【研究意義】斜紋夜蛾（Spodoptera litura）是一種食性雜、繁殖力強(qiáng)的鱗翅目夜蛾科害蟲，其可危害300多種植物，對(duì)農(nóng)作物的種植經(jīng)濟(jì)效益造成嚴(yán)重影響（張南等，2016;張麗麗等，2018）?；瘜W(xué)防治在斜紋夜蛾的防治中一直占據(jù)主導(dǎo)地位，勢(shì)必引起斜紋夜蛾對(duì)多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性（聶南生等，2007;桑松等，2013;Armes et al.，2015），致使化學(xué)藥劑的防治效果明顯下降，導(dǎo)致農(nóng)戶過(guò)度濫用化學(xué)藥劑而影響作物的綠色生產(chǎn)。因此，尋找新的藥物作用靶標(biāo)將成為防治斜紋夜蛾的新途徑。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerase，PDI）是一個(gè)多功能蛋白，其不僅參與蛋白二硫鍵的形成、蛋白折疊及翻譯后修飾等過(guò)程（Wilkinson and Gilbert， 2004），還可作為分子伴侶抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集，幫助蛋白重新正確折疊（Puig and Gilbert，1994）。因此，以PDI蛋白為藥物作用靶標(biāo)可為斜紋夜蛾的防治提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PDI可促進(jìn)蛋白二硫鍵的形成和催化配對(duì)錯(cuò)誤二硫鍵的重排，進(jìn)而穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，屬于蛋白二硫鍵/巰基氧化還原蛋白超家族（Hatahet and Ruddock，2009）。Goo等（2002）報(bào)道，PDI在家蠶（Bombyx mori）抵御細(xì)菌入侵過(guò)程中起到重要作用。Bourchookarn等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，受黃頭病毒（YHV）感染后，斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）體內(nèi)的PDI表達(dá)量明顯提高。李燕等（2013）利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)在萊氏野村菌的誘導(dǎo)下，斜紋夜蛾P(guān)DI表達(dá)量顯著上調(diào)?？梢?jiàn)，PDI是一種應(yīng)激蛋白，對(duì)病毒、細(xì)菌的侵染具有防御功能。此外，Hu等（2010）在桔小實(shí)蠅化學(xué)感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）互作蛋白的篩選中發(fā)現(xiàn)PDI與CSP具有一定的親和性，推測(cè)其可能參與昆蟲化學(xué)感受蛋白中二硫鍵的形成，并在昆蟲生命活動(dòng)中扮演著重要角色。【本研究切入點(diǎn)】PDI不僅可修飾重要的功能蛋白結(jié)構(gòu)，還可防御病毒、細(xì)菌等外來(lái)生物的侵染。因此，以斜紋夜蛾P(guān)DI蛋白為藥物作用靶標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)藥物，可有效干擾斜紋夜蛾一些重要功能蛋白的正確折疊或降低其對(duì)外來(lái)生物的抵御能力，為斜紋夜蛾的防控提供新策略。但目前關(guān)于斜紋夜蛾P(guān)DI蛋白其他生理功能的報(bào)道相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以斜紋夜蛾為試驗(yàn)材料，定量比較從幼蟲到新羽化成蟲等不同發(fā)育時(shí)期斜紋夜蛾蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因（SlitPDI）的mRNA表達(dá)量變化模式，以期解析SlitPDI蛋白在斜紋夜蛾發(fā)育過(guò)程中的生理功能，為斜紋夜蛾的行為調(diào)控提供重要的作用靶標(biāo)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試?yán)ハx 斜紋夜蛾采集自廣州從化十字花科蔬菜田，于仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度26～27 ℃，相對(duì)濕度75%～80%，光周期L∶D=16 h∶8 h。

1. 1. 2 主要試劑 RNA提取試劑盒（R6834）和DNaseΙ購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex Taq DNA聚合酶和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)自廣州瑞真生物工程有限公司。

1. 2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

參照RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取斜紋夜蛾2齡、4齡、6齡幼蟲及蛹和雌雄成蟲（新羽化）6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的樣品總RNA，RNA質(zhì)量檢查合格后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，并貯存于-20 ℃冰箱備用。

1. 3 序列生物信息學(xué)分析

利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)選取的21種昆蟲PDI蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析;使用DNASTAR的MegAlign程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并與SlitPDI蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。

1. 4 SlitPPDI基因表達(dá)分析

根據(jù)已登錄的SlitPDI（GenBank登錄號(hào)JX18 3988）和actin（GenBank登錄號(hào)KP331524）的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物PDIQF（5'-TCCATCAAGCTGGCTAAGGT-3'）和PDIQR（5'-ATCAATAGGGCTGCCGTTC-3'）;actF（5'- TTCCCGACGGACAAGTCAT-3'）和actR（5'-GCATA CGGTCAGCAATACCAG-3'）。引物均由廣州英駿生物技術(shù)有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，SYBR預(yù)混液12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，滅菌超純水8.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 10 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，分別檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，再用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SlitPDI生物信息學(xué)分析結(jié)果

分析結(jié)果顯示，SlitPDI基因編碼494個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該蛋白分子量約55.3 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.52。將選取的昆蟲PDI蛋白與SlitPDI蛋白進(jìn)行氨基酸序列一致性分析，結(jié)果（圖1）表明，4條不同目的昆蟲PDI蛋白具有較高的序列一致性，且序列中均包含2個(gè)-Cys-X-Y-Cys-（-CGHC-）位點(diǎn)，該位點(diǎn)是PDI蛋白序列的典型特征。

將SlitPDI基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與所選的21種昆蟲PDI蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并采用MegAlin中的ClustalW方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果（圖2）表明，SlitPDI與意大利蜜蜂（Apis mellifera）PDI序列的一致性最低，為50.2%。在昆蟲綱中SlitPDI蛋白與家蠶PDI序列的一致性最高，為83.4%。由圖2可知，21條PDI序列分別聚為四大支，第一支對(duì)應(yīng)雙翅目昆蟲的PDI序列;第二支對(duì)應(yīng)膜翅目昆蟲的PDI序列;第三支對(duì)應(yīng)鱗翅目昆蟲的PDI序列;第四支對(duì)應(yīng)鞘翅目昆蟲的PDI序列。Slit-PDI蛋白序列與鱗翅目中的家蠶和君主斑蝶（Danaus plexippus）的親緣關(guān)系較近，聚為一支。

2. 2 不同發(fā)育期SlitPDI基因的mRNA表達(dá)分析結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，SlitPDI基因在斜紋夜蛾的各發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，2齡和4齡幼蟲中SlitPDI mRNA表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì)，4齡幼蟲中表達(dá)量達(dá)最高峰。以2齡幼蟲SlitPDI基因mRNA含量為基準(zhǔn)含量，4齡幼蟲的表達(dá)量是基準(zhǔn)含量的127%;但在6齡幼蟲和蛹中其表達(dá)量又突然下降，分別為基準(zhǔn)含量的59%和55%;隨后其在新羽化雌、雄成蟲中的表達(dá)量又呈增加趨勢(shì)，分別為基準(zhǔn)含量的103%和112%。

3 討論

PDI蛋白屬于硫氧還蛋白超家族，一般由a、a'、b和b'共4個(gè)活性結(jié)構(gòu)域組成，其中a和a'區(qū)域具有催化活性域的典型序列特征-CGHC-;而b和b'不具催化活性（Kemmink et al.，1997;Benham et al.，2000）。不同物種的催化活性域-CGHC-的個(gè)數(shù)不同，含有2個(gè)活性域的為Ⅰ類PDI家族蛋白，含有3個(gè)活性域的為Ⅱ類PDI家族蛋白（Frand and Kaiser，2000;Ren et al.，2011;李燕等，2013）。本研究對(duì)來(lái)自家蠶、赤擬谷盜、黑腹果蠅及斜紋夜蛾等4種不同目的昆蟲PDI蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這4種蛋白的N端和C端各具有一個(gè)高度保守的氧化還原活性域-CGHC-，因此，SlitPDI蛋白屬于Ⅰ類PDI家族蛋白。本研究的氯基酸序列聚類分析結(jié)果表明同一目的昆蟲PDI序列均聚在一起，序列的聚類關(guān)系與各物種的分類地位一致。

PDI是一種重要的折疊酶，可催化新生肽鏈中二硫鍵的形成和異構(gòu)化，在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性方面發(fā)揮重要作用（Benham et al.，2000;王志強(qiáng)等，2009）。胡黎明等（2012）研究表明桔小實(shí)蠅PDI基因在其1 d蛹中的mRNA表達(dá)量最高，并發(fā)現(xiàn)從3齡幼蟲到蛹的發(fā)育過(guò)程中其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，推測(cè)PDI可能在桔小實(shí)蠅化蛹過(guò)程中發(fā)揮重要作用。李燕等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，SlitPDI在脂肪體、頭部、中腸、馬氏管、體壁和血液等組織中均有表達(dá)，但在血液中表達(dá)量最高，脂肪體次之，頭部最低。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了SlitPDI基因在斜紋夜蛾不同發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)量變化情況，旨在分析SlitPDI在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理功能，結(jié)果表明，SlitPDI基因在斜紋夜蛾4齡幼蟲中的表達(dá)量最高，在其新羽化成蟲中的表達(dá)量次之。因此，推測(cè)SlitPDI在斜紋夜蛾4齡幼蟲和剛羽化成蟲等發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但具體功能還有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究分析了SlitPDI蛋白的生物信息學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)SlitPDI蛋白的氨基酸序列具有2個(gè)高度保守的氧化還原活性域-CGHC-，屬于Ⅰ類PDI家族蛋白。SlitPDI基因在斜紋夜蛾4齡幼蟲和新羽化成蟲中的表達(dá)量相對(duì)較高。

參考文獻(xiàn)：

胡黎明，申建梅，胡美英，賓淑英，黃華枝，廖泓之，林進(jìn)添. 2012. 桔小實(shí)蠅二硫鍵異構(gòu)酶基因的克隆及其發(fā)育表達(dá)[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 31（4）：457-462. [Hu L M， Shen J M， Hu M Y， Bin S Y， Huang H Z， Liao H Z， Lin J T. 2012. Cloning and developmental expression pa-ttern analysis of PDI in Bactrocera dorsalis（Hendel）[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，31（4）：457-462.]

李燕，王中康，陳環(huán)，馮二艷，殷幼平. 2013. 斜紋夜蛾SpLPDI的克隆、表達(dá)及其對(duì)萊氏野村菌的免疫應(yīng)答分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（7）：1359-1369. [Li Y， Wang Z K， Chen H， Feng E Y， Yin Y P. 2013. Molecular cloning and expression pattern analysis of a protein disulfide isomerases （SpLPDI） in Spodoptera litura[J]. Scientia Agricultura Sinica， 46（7）：1359-1369.]

聶南生，黃水金，龍丘陵. 2007. 斜紋夜蛾的抗藥性及其治理策略[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 19（7）：51-54. [Nie N S， Huang S J， Long Q L. 2007. Insecticide-resistance and control strategy for common cutworm， Spodoptera litura（Fab.） [J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 19（7）：51-54.]

桑松，王政，齊江衛(wèi)，舒本水，鐘國(guó)華. 2013. 斜紋夜蛾抗藥性研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)， 35（6）：808-814. [Sang S， Wang Z， Qi J W， Shu B S， Zhong G H. 2013. Research progresses on pesticide resistance of Spodoptera litura[J]. Journal of Environmental Entomology， 35（6）：808-814.]

王志強(qiáng)，周智敏，郭占云. 2009. 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 生命科學(xué)研究，13（6）：548-552. [Wang Z Q， Zhou Z M， Guo Z Y. 2009. The structure and function of the protein disulfide isomerase family[J]. Life Science Research，13（6）：548-552.]

張麗麗，武怡瓊，楊正飛，郭麗，魏佳平，闞云超. 2018. 斜紋夜蛾保幼激素環(huán)氧水解酶基因的克隆和原核表達(dá)[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（12）：84-89. [Zhang L L，Wu Y Q，Yang Z F，Guo L，Wei J P，Kan Y C. 2018. Cloning and prokaryotic expression of JHEH gene from Spodoptera litura[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，47（12）：84-89.]

張南，陳巨龍，仵均祥. 2016. 斜紋夜蛾半人工飼料的改進(jìn)[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），44（4）：109-113. [Zhang N，Chen J L，Wu J X. 2016. Improvement of semi-artificial diet for Spodoptera litura[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），44（4）：109-113.]

Armes N J，Wightman J A，Jadhav D R，Rao G V. 2015. Status of insecticide resistance in Spodoptera litura in andhra pradesh，India[J]. Pest Management Science，50（3）：240-248.

Benham A M，Cabibbo A，F(xiàn)assio A，Bulleid N，Sitia R，Braakman I. 2000. The CXXCXXC motif determines the fol-ding，structure and stability of human Ero1-Lalpha[J]. The EMBO Journal，19（17）： 4493-4502.

Bourchookarn A，Havanapan P O，Thongboonkerd V，Krittanai C. 2008. Proteomic analysis of altered proteins in lymphoid organ of yellow head virus infected Penaeus mo-nodon[J]. Biochimica et Biophysica Acta-biomembranes，1784： 504-511.

Frand A R， Kaiser C A. 2000. Two pairs of conserved cystei-nes are required for the oxidative activity of Ero1p in protein disulfide bond formation in the endoplasmic reticu-lum[J]. Molecular Biology of the Cell， 11：2833-2843.

Goo T W， Yun E Y， Hwang J S， Kang S W， Park S， You K H， Kwon O Y. 2002. Molecular characterization of a Bombyx mori protein disulfide isomerase（bPDI）[J]. Cell Stress & Chaperones，7（1）： 118-125.

Hatahet F，Ruddock L W. 2009. Protein disulfide isomerase： A critical evaluation of its function in disulfide bond formation[J]. Antioxidants and Redox Signalling，11（11）： 2807-2850.

Hu L M，Shen J M，Hu M Y，Muhammad R. 2010. Screening of T7 phage displayed Bactrocera dorsalis（Hendel） antenna cDNA library against chemosensory protein[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，75（3）： 174-186.

Kemmink J，Darby N J，Dijkstra K，Dijkstra K，Nilges M，Creighton T E. 1997. The folding catalyst protein disulfide isomerase is constructed of active and inactive thioredoxin modules[J]. Current Biology，7（4）： 239-245.

Puig A， Gilbert H F. 1994. Anti-chaperone behavior of BiP du-ring the protein disulfide isomerase-catalyzed refolding of reduced denatured lysozyme[J]. The Journal of Biological Chemistry， 269（41）：25889-25896.

Ren Q A，Zhou J，Sun S S，Kang C J，Zhao X F，Wang J X. 2011. Molecular cloning and expression pattern analysis of two novel disulfide isomerases in shrimp[J]. Compara-tive Biochemistry and Physiology：Part C，153（3）：301-309.

Wilkinson B，Gilbert H F. 2004. Protein disulfide isomerase[J]. Biochimica et Biophysica Acta-biomembranes，1699： 35-44.

（責(zé)任編輯 麻小燕）