楊珂　周延清　段紅英　郭萌萌

摘 要：該研究采用L（5）正交設(shè)計(jì)和單因素兩種方法，對影響地黃SCoT-PCR反應(yīng)的5個(gè)因素（模板 DNA 濃度，引物濃度，ddH2O和Mix的用量以及退火溫度）進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：優(yōu)化后的反應(yīng)體系總體積為25 μL，含有8 μL ddHO，1 μL模板DNA（80 ng·μL），1 μL引物（8 μmol·L）和15 μL Mix，退火溫度為45 ℃。運(yùn)用30份地黃種質(zhì)材料，對優(yōu)化的SCoT-PCR正交體系進(jìn)行多次重復(fù)驗(yàn)證，獲得了多態(tài)性豐富、條帶清晰的擴(kuò)增圖譜，證明該反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。利用該體系對32條SCoT引物進(jìn)行兩次篩選，得到14個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、重復(fù)性好且多態(tài)性條帶相對較高的引物。利用SCoT4等5條引物構(gòu)建了上述地黃2個(gè)種共30份種質(zhì)的SCoT指紋圖譜。利用這5個(gè)SCoT引物指紋圖譜可將7個(gè)地黃常用栽培品種區(qū)分開。這表明SCoT分子標(biāo)記體系適用于地黃主要品種親緣關(guān)系及遺傳多樣性的研究，所構(gòu)建的指紋圖譜也為地黃常見的7個(gè)栽培品種的區(qū)分提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）， 單因素試驗(yàn)， 正交設(shè)計(jì)， 引物篩選， 品種鑒定

中圖分類號：Q949.9， O413

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）05-0608-07

SCoT molecular marker system and fingerprintin Rehmannia glutinosa

YANG Ke1， ZHOU Yanqing1，2，3*， DUAN Hongying1， GUO Mengmeng1

（ 1. College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China; 2. Key Laboratory for Microorganisms and FunctionalMolecules， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China; 3. Engineering Technology Research Center of Nursing andUtilization of Genuine Chinese Crude Drugs， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China ）

Abstract：We used L25（5） orthogonal design and single factor method to optimize the five factors （template DNA concentration， primer concentration， ddH2O， Mix amount and annealing temperature） that affect the SCoT-PCR reaction ofRehmannia glutinosa. The results were as follows： The reaction system was a total volume of 25 μL containing 8 μL of ddH2O， 1 μL of template DNA （80 ng·μL）， 1 μL of primer （8 μmol·L） and 15 μL of Mix， and an annealing temperature of 45℃. The optimized SCoT-PCR orthogonal system was repeatedly verified by using 30 parts of Rehmanniagermplasm materials， and the amplified spectrum with rich polymorphism and clear bands was obtained， which proves that the reaction system is stable and reliable. Using this system， 32 SCoT primers were screened twice， and 14 primers with clear， reproducible and relatively high polymorphic bands were obtained. Finally， SCoT fingerprints of 30 species of the above two species of Rehmannia were constructed by using five primers such as SCoT4. Using these five SCoT primer fingerprints， seven common cultivars of Rehmannia glutinosacan be distinguished. The study indicates that the SCoT molecular marker system is suitable for the study of genetic relationship and genetic diversity of the main varieties of Rehmannia glutinosa. The fingerprints constructed also provide reference for the differentiation of seven cultivars commonly found in Rehmannia glutinosa.

Key words： target initiation codon polymorphism （SCoT）， single factor test， orthogonal design， primer screening， variety identification

地黃（Rehmannia glutinosa）是玄參科地黃屬多年生草本植物，包括天目地黃、裂葉地黃、高地黃、湖北地黃、茄葉地黃與地黃6個(gè)種，分布于中國、日本和韓國等國家。在我國，地黃主要分布于河南、山西、遼寧、山東、陜西和安徽等地。地黃根作為藥材和食材，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，地黃備受人們青睞，廣為研究。

就地黃DNA分子標(biāo)記研究而言，迄今已有RAPD、ISSR、SRAP、SCAR、ITS、AFLP、葉綠體DNA非編碼區(qū)片段和EST-SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于地黃遺傳多樣性評價(jià)、分類、鑒定、指紋圖譜、居群遺傳關(guān)系、結(jié)構(gòu)及診斷莖尖快速繁殖地黃品種和F1代雜種（周延清等，2015;王婉珅，2016;夏至等，2016）、種的鑒定等方面（馮法節(jié)等， 2015;Liu et al.， 2015）。但是，這些標(biāo)記各有缺點(diǎn)。譬如，RAPD標(biāo)記、AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記依次具有不穩(wěn)定性、費(fèi)時(shí)與昂貴和難以開發(fā)等缺點(diǎn)，所以，需要開發(fā)新地黃分子標(biāo)記。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（start codon targeted polymorphism，SCoT）標(biāo)記是一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的新型目的基因分子標(biāo)記，是根據(jù)植物基因ATG起始密碼子側(cè)翼保守區(qū)域設(shè)計(jì)單引物，對基因組中ATG兩側(cè)的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記，具有能獲得與性狀聯(lián)系緊密的目的基因、能對性狀進(jìn)行跟蹤、操作簡單、重復(fù)性好﹑多態(tài)性豐富與引物通用性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于硬粒小麥遺傳多樣性分析（Guo et al.，2016）、間接器官發(fā)生途徑再生火索麻植株的遺傳純合率（Mariappan et al.，2016）、基因差異表達(dá)和分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面（龍治堅(jiān)等，2015）。

迄今，SCoT標(biāo)記技術(shù)尚未見地黃應(yīng)用方面的報(bào)道，從分子角度探討地黃遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究也相對較少（陳大霞等，2012）。因此，本研究以開發(fā)地黃新分子標(biāo)記為目的，以地黃為材料，構(gòu)建與優(yōu)化地黃SCoT-PCR體系，并篩選合適引物，對30份種質(zhì)進(jìn)行了SCoT指紋圖譜的構(gòu)建，為地黃遺傳多樣性分析和品種鑒定等研究奠定基礎(chǔ)，也為地黃常見的7個(gè)栽培品種紅薯王、抗育831、北京3號、北京2號、金狀元、金九和溫85-5的區(qū)分提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用地黃種質(zhì)收集于河南4個(gè)市縣、山東2個(gè)區(qū)縣和上海華東師范大學(xué)，包括裂葉地黃（Rehmannia piasezkii）和地黃（Rehmannia glutinosa）這2個(gè)種，共30份種質(zhì)。具體如下：1.靈寶野生;2.上作1;3.山西北相;4.金線吊魚;5.密縣野生;6.郭里毛;7.紅薯王;8.組培9302;9.抗育831;10.古賢地黃;11.皇后雜;12.北京3號;13.靈寶野生;14.三塊;15.方莊地黃;16.溫懷地黃;17.北京2號;18.金狀元;19.范山地黃;20.獅子頭;21.上作2;22.張寺961;23.金九;24.文昌地黃;25.泰山地黃;26.舞陽地黃;27.野生地黃;28.裂葉地黃;29.溫85-5;30.衛(wèi)輝地黃。其中，1-23號取自溫縣農(nóng)科所，24號取自濟(jì)南文昌山，25號取自濟(jì)南泰安泰山，26號取自漯河舞陽縣，27號取自靈寶縣胡家原村，28號取自華東師范大學(xué)，29號取自河南師范大學(xué)，30號取自衛(wèi)輝市比干廟。2016年5月由研究生王婉珅采集的新鮮幼嫩葉子， 每個(gè)產(chǎn)地共采集三株作為重復(fù)，經(jīng)硅膠快速干燥后保存于-70 ℃冰箱備用。均經(jīng)過河南師范大學(xué)段紅英教授鑒定和王婉珅研究生ITS測序與NCBI比對，確定為裂葉地黃或地黃種質(zhì)（王婉珅，2016）。試驗(yàn)用的Taq MasterMix由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司合成。從文獻(xiàn)（陳大霞等，2012;李丕睿等， 2013;蔣雅琴等， 2014）查選的32個(gè)單引物序列，由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成，命名為SCoT1-SCoT32。

1.2 DNA的提取與檢測

取新鮮地黃葉片，根據(jù)改良的CTBA提取葉片DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度，將樣品按所需濃度稀釋，置于-20 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基礎(chǔ)SCoT-PCR體系的建立與目標(biāo)引物的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)（徐林濤， 2015; Guo et al.， 2016; Mahjbi et al.， 2015）初步建立基礎(chǔ)的地黃SCoT-PCR反應(yīng)體系，對32條引物進(jìn)行初次的篩選。SCoT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含8 μL ddH2O、1 μL模板DNA（80 ng·μL-1）、1 μL引物（8 μmol·L-1）、10 μL Mix。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 4 min;94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，拍照分析。

1.4 SCoT-PCR的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

溫85-5為地黃最常見的栽培品種。選取溫85-5品種DNA為模板，以1.3中篩選的SCoT15為引物，針對模板DNA濃度、引物濃度、ddH2O體積、PCR反應(yīng)體系中 Mix的用量和退火溫度5種因素設(shè)置5個(gè)不同水平（表1）。采用 L25（56）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對基礎(chǔ)SCoT-PCR 進(jìn)行體系優(yōu)化，2次重復(fù)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在梯度PCR 儀Tgradient上進(jìn)行，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 4 min;94 ℃變性1min，退火溫度的設(shè)定依據(jù)正交表1 min，72 ℃延伸2 min， 36個(gè)循環(huán);4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，吸取擴(kuò)增產(chǎn)物 8～10 μL進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，電極緩沖液為 1×TAE，在Gel DoctmEZ凝膠成像儀拍照。

1.5 退火溫度優(yōu)化

退火溫度是影響 PCR 特異性的重要因素。根據(jù)正交試驗(yàn)篩選出的最有體系設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，對退火溫度再次進(jìn)行梯度優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)置了 5個(gè)溫度梯度： 45.0、47.0、51.3、53.3、55.0 ℃。 除退火溫度不同外，反應(yīng)程序與篩選出的正交試驗(yàn)體系相同。

1.6 正交試驗(yàn)最優(yōu)體系的驗(yàn)證

用1.3中篩選的14條引物和1.5中優(yōu)化后的正交體系，對30份地黃種質(zhì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，驗(yàn)證該體系的穩(wěn)定性、通用性和重復(fù)性，同時(shí)對14條引物進(jìn)行第二次篩選。對所得的SCoT譜帶保存并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用人工讀帶的方法，根據(jù)SCoT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳上的相對位置，依據(jù)分子量從大到小的順序讀帶，對電泳圖譜上清晰且可辨認(rèn)的條帶記為 1，無條帶記為 0，缺失記為 9，模糊不清的不予記錄，建立30份地黃種質(zhì)的SCoT指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃DNA質(zhì)量和濃度的檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，檢測結(jié)果顯示所得的 DNA條帶清晰完整，無拖尾和蛋白質(zhì)污染。取1 μL提取的DNA，以ddH2O作為基準(zhǔn)，用微量分光光度計(jì)測定其濃度和純度，OD260/OD280均在1.8～2.0之間，說明所提取的地黃DNA較純凈，無雜質(zhì)污染，可進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

2.2 基礎(chǔ)SCoT-PCR體系建立和篩選引物

利用基礎(chǔ)體系與擴(kuò)增程序，以溫85-5、金九、金狀元、紅薯王等地黃常見栽培種質(zhì)的DNA模板，對32條 SCoT 引物進(jìn)行SCoT-PCR篩選（圖1）。初次獲得擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、重復(fù)性好且多態(tài)性條帶相對較高的14條引物SCoT4：ACCATGGCTACCACCGCG;SCoT5：ACGACATGGCGACCGCGA;SCoT11：CAACAATGGCTACCACGT;SCoT14：AAGCAATGGCTACCACCA;SCoT15：ACGACATGGCGACCATCG;SCoT16：ACGACATGGCGACCACGC;SCoT19：ACCATGGCTACCACCGGC;SCoT21：GCAACAATGGCTACCACC;SCoT23：ACCATGGCTACCACCGCA;SCoT25：CCATGGCTACCACCGGCC;SCoT26：CCATGGCTACCACCGGCG;SCoT27：CCATGGCTACCACCGCCT;SCoT28：CCATGGCTACCACCGCAG;SCoT29：ACGACATGGCGACCAACG，并正式用于PCR 擴(kuò)增。

2.3 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證

從正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果可以看出，25個(gè)處理組合中有18個(gè)產(chǎn)生譜帶，其中10號、14號、16號、18號、20號、22號和23號處理組合沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物，5號、6號、7號和19號擴(kuò)增產(chǎn)物極少，8號和9號處理組合擴(kuò)增譜帶清晰，易于辨認(rèn)，呈現(xiàn)多態(tài)性（圖2）。綜合各個(gè)條帶的直觀分析，最終確定地黃SCoT-PCR 的最佳反應(yīng)體系為ddH2O 8 μL，模板DNA用量80 ng·μL-1，引物8 μmol·L-1 ，Mix15 μL，退火溫度45 ℃，總體積25 μL。

2.4 退火溫度優(yōu)化

在研究的 5個(gè)退火溫度（圖3）中，45.0 ℃擴(kuò)增的條帶背景較強(qiáng)，條帶易于辨認(rèn)且特異性強(qiáng);47.0 ℃和55.0 ℃擴(kuò)增的條帶少且背景較弱;51.3 ℃和53.3 ℃隨著退火溫度的升高，擴(kuò)增條帶數(shù)目增加，背景增強(qiáng)，但當(dāng)退溫度上升到55.0 ℃時(shí)，背景又變?nèi)?。因此，以條帶擴(kuò)增清晰、呈現(xiàn)多態(tài)性為依據(jù)，確定本試驗(yàn)的最佳退火溫度為45.0 ℃。

2.5 地黃最適反應(yīng)體系的驗(yàn)證

用初次篩選的14條引物，對30份地黃種質(zhì)DNA模板進(jìn)行SCoT-PCR分析，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。除SCoT21和SCoT25外，所用引物均能在供試材料中擴(kuò)增出條帶清晰、亮度適中、多態(tài)性高的條帶。如SCoT15在30份地黃材料中的擴(kuò)增譜帶清晰、易于辨認(rèn)、呈現(xiàn)多態(tài)性（圖4）。這說明建立和優(yōu)化的SCoT分子標(biāo)記反應(yīng)體系適用于地黃基因組DNA的遺傳多樣性等后續(xù)研究。

2.6 SCoT引物擴(kuò)增分析

通過對32條SCoT引物的兩次篩選，得到14個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、重復(fù)性好且多態(tài)性條帶相對較高的引物。利用篩選的14條SCoT引物對30份地黃種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增分析，研究結(jié)果表明：（1） 14條SCoT引物對30份地黃材料共擴(kuò)增出103個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有96個(gè)，多態(tài)率達(dá)94.2%;（2） 30份材料的遺傳相似系數(shù)在0.471 9～0.922 3之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.70，說明 SCoT 標(biāo)記能夠顯示品種間較高的遺傳多樣性。在最終選擇5條引物用于構(gòu)建30份地黃種質(zhì)的指紋圖譜，利用這5條SCoT多態(tài)性引物指紋圖譜可將7個(gè)地黃常用栽培品種區(qū)分開。

2.7 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)5條引物SCoT4、SCoT5、SCoT11、SCoT15和SCoT 27的擴(kuò)增結(jié)果，對電泳圖譜上清晰且可辨認(rèn)的條帶記為1，無條帶記為0，缺失記為9，模糊不清的不予記錄，建立30份地黃種質(zhì)的SCoT指紋圖譜數(shù)字化表格（表2），利用此5條SCoT多態(tài)性引物可有效區(qū)分地黃7個(gè)常用栽培品種。利用引物SCoT4產(chǎn)生的特異性條帶可以將北京2號、金狀元和金九區(qū)分開，引物SCoT27可將紅薯王和抗育831區(qū)別開，利用引物SCoT5可擴(kuò)增出北京3號的特異性條帶，引物SCoT11可產(chǎn)生溫85-5的特異性條帶，引物SCoT27能擴(kuò)增出金九的特異性條帶。

3 討論

本研究篩選的14條 SCoT引物在30份地黃資源中具有很高的多態(tài)性，平均多態(tài)率達(dá)到94.2%，其引物多態(tài)性效果比一些報(bào)道的結(jié)果好。如李丕睿等（2013）對18份菊花材料進(jìn)行多樣性研究發(fā)現(xiàn)，12 條 SCoT引物的平均多態(tài)率為90.4%;在蔣雅琴等（2014）對81份絲瓜品種的研究中，10條引物的多態(tài)率為87.57%。利用這些引物能在部分栽培品種中擴(kuò)增出特異性條帶，這些特異性條帶是否與特定性狀有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究證明。

本研究以開發(fā)地黃新分子標(biāo)記為目的，克服上述SCoT-PCR技術(shù)的不足，建立并優(yōu)化出適宜的地黃SCoT-PCR反應(yīng)體系，即總體積25 μL，包含ddH2O 8μL，模板DNA用量80 ng·μL-1，引物8 μmol·L-1，Mix 15 μL，退火溫度45 ℃。該SCoT-PCR 體系已在地黃栽培種、地黃屬的2個(gè)不同種之間、農(nóng)家種與野生種上進(jìn)行了通用性和穩(wěn)定性驗(yàn)證，都得到了特異性豐富的譜帶，表明其適于地黃屬種質(zhì)的指紋圖譜構(gòu)建和鑒定及遺傳多樣性分析等，也為其SCAR標(biāo)記開發(fā)等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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