云南地區(qū)非小細(xì)胞肺癌外周血EGFR基因突變檢測(cè)分析

崔靜 楊麗琳 宋蜀伶 方虹 強(qiáng) 潘鑫艷

【摘 ???要】 ???目的：探討云南地區(qū)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者外周血中表皮因子生長(zhǎng)受體（EGFR）基因突變情況。方法：收集2017年10月-2019年7月本院云南地區(qū)晚期NSCLC患者外周血標(biāo)本37例，運(yùn)用ARMS-Taqman 探針?lè)z測(cè)標(biāo)本中EGFR 基因突變情況。結(jié)果：37例血液標(biāo)本中，14例（37.8%）存在EGFR基因突變，其中19Del占總突變的28.6%（4/14），L858R 占總突變的42.8%（6/14），L858R、19Del占總突變的71.4%（10/37），有2例同時(shí)存在L858R、T790M突變;2例同時(shí)存G719X、S768I 雙突變14.3%（2/14）;2例存在L861Q突變14.3%（2/14）。結(jié)論：云南地區(qū)外周血EGFR 基因突變檢測(cè)率與國(guó)內(nèi)其他報(bào)道一致，主要以EGFR基因L858R及19Del突變?yōu)橹?但云南地區(qū)的S768I 則明顯高于其他地區(qū)。

【中圖分類號(hào)】R821.4+2 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ???【文章編號(hào)】1004-7484（2019）04-0091-02

肺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的80%～90%，惡性程度高。在我國(guó)，肺癌已成為惡性腫瘤第一死因，而云南省的肺癌發(fā)病率與死亡率一直在國(guó)內(nèi)位居榜首，特別是云南宣威地區(qū)，發(fā)病率是全國(guó)平均水平的20倍。70%～80%的NSCLC患者確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)治療或根治性放療的機(jī)會(huì)，晚期NSCLC全身化療中位生存期僅為8～10個(gè)月。隨著對(duì)肺癌生物標(biāo)志物的深入研究和致病機(jī)理的逐步闡明，分子靶向治療已經(jīng)成為肺癌綜合治療中的最新模式，受到廣泛關(guān)注。目前NSCLC治療的重要方向之一是以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）為靶點(diǎn)的分子靶向治療。EGFR基因突變主要發(fā)生在18～21外顯子， 大量臨床研究顯示檢測(cè)EGFR基因突變可以篩查對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）靶向藥敏感的患者，從而實(shí)現(xiàn)靶向個(gè)體化治療。

但是臨床上常由于多種原因，如肺癌病理組織標(biāo)本過(guò)少、患者病情過(guò)重?zé)o法耐受獲取組織標(biāo)本的相關(guān)檢查，創(chuàng)傷大，操作繁瑣等，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行組織學(xué)EGFR 突變檢測(cè)，從而缺乏使用EGFR-TKIs治療的依據(jù)。近年來(lái)，NSCLC患者的外周血循環(huán)DNA分析可一定程度反映腫瘤情況，其檢測(cè)得到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血腫瘤DNA含量明顯高于正常人群，且外周血腫瘤DNA 與腫瘤組織DNA 具有類似的遺傳學(xué)特性，有數(shù)據(jù)顯示血液EGFR水平與組織樣本的一致性為60%～95%。楊長(zhǎng)紹等對(duì)云南地區(qū)NSCLC患者組織標(biāo)本的EGFR基因突變進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了具有顯著的地區(qū)差異性，本文就云南地區(qū)NSCLC患者外周血中的EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)分析。

1 ???材料和方法

1.1 臨床資料

本院自2017年10月至2019年7月共收治37例僅有細(xì)胞學(xué)標(biāo)本但無(wú)組織學(xué)標(biāo)本、僅行外周血EGFR突變檢測(cè)的Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者。其中男20例，女17例;年齡36～69歲，中位年齡55歲;有吸煙史者20例，無(wú)吸煙史者26例;腺癌36例。

1.2 外周血EGFR檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集

常規(guī)采血10 ml，用一次性真空采血管（游離DNA保護(hù)專用） 接采血針收集血樣10 ml，立即輕柔地上下顛倒采血管8～10次，并于4 h內(nèi)提取游離DNA。

1.2.2 血漿分離

全血4000 rpm 離心10 min，取上清（吸取時(shí)槍尖離底部殘留物2～3 mm），此上清即為血漿（≥2 ml） 。

1.2.3 DNA提取

取4 ml血漿樣品（不少于3 ml），加入1.8 ml Buffer CDL，再加入50μl蛋白酶K液，充分混勻10 s， 63℃水浴消化15 min。快速冷卻至室溫，加入400μl DNA Tracer 混勻，再加入3.3ml 預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，10000 rpm 離心5 min，棄上清;往沉淀中加入470μl Buffer CDB 與10μl蛋白酶K液，63℃消化10 min，快速冷卻至室溫，加入200μl無(wú)水乙醇，將沉淀吹打混勻。將沉淀混合液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中，10000 rpm 離心30 s，棄廢液。加入700 μl Buffer CW1， 10000 rpm 離心30 s;加入700 μl Buffer CW2， 10000 rpm 離心30 s，;加入700 μl 無(wú)水乙醇，10000 rpm 離心30 s，更換收集管， 13000 rpm 離心5 min;將吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 ml離心管中，往吸附膜中心滴加50 μl Buffer CDE，90℃孵育5 min， 13000 rpm 離心1 min，收集樣品DNA。

1.2.4 DNA濃度測(cè)定

用微量紫外分光光度測(cè)定DNA 樣品的濃度及OD260/OD280值。

1.2.5 ARMS法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增

人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。取42.3 μl 樣品DNA，加入2.7 μl Taq 酶（EGFR） ，混勻后向每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入5μl。將8連排反應(yīng)條蓋上蓋子，離心后放入實(shí)時(shí)定量PCR儀中。每輪反應(yīng)設(shè)置陰陽(yáng)對(duì)照各一。擴(kuò)增程序： 95℃ 5 min; 95℃25 s， 64℃ 20 s，72℃ 20 s，15 個(gè)循環(huán); 93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s， 31 個(gè)循環(huán)，在60℃時(shí)收集FAM/VIC 熒光信號(hào)。

1.2.6 結(jié)果判定

陰性對(duì)照無(wú)信號(hào)，陽(yáng)性對(duì)照Ct值<20。待測(cè)樣品內(nèi)控、外控信號(hào)應(yīng)升起，外控信號(hào)應(yīng)在13～19。滿足上述條件的試驗(yàn)結(jié)果為可信結(jié)果。突變Ct值≥陰性臨界值時(shí)為（-），<陽(yáng)性臨界值為強(qiáng)（+）。當(dāng)突變Ct值≥陽(yáng)性臨界值且<陰性臨界值時(shí)，計(jì)算△Ct值（△Ct 值=突變Ct值-外控Ct值）。若△Ct值<相應(yīng)的△Ct Cut-off 值，則該樣品為弱（+）;若△Ct值>相應(yīng)的△Ct Cut-off值，則該樣品為（-）。

2 ???結(jié)果

2.1 血漿DNA質(zhì)量控制

用微量紫外分光光度儀測(cè)定DNA 樣品的濃度，平均濃度為11.02 ngμl，平均OD260/OD280 比值為1.96。

2.2 EGFR基因突變頻率與類型

云南地區(qū)37例中血液標(biāo)本中，14例（37.8%）存在EGFR 基因的突變，其中EGFR基因外顯子21 L858R突變率最高，為42.8%（6/14）;其次為19 缺失突變（28.6%，4/14）;19Del、L858R 占總突變的71.4%（10/14）;2例患者（14.3%，2/14）同時(shí)出現(xiàn)外顯子18 G719X 和外顯子20 S761I 雙突變， S761I無(wú)獨(dú)立突變，與18外顯子G719X伴隨存在;2例患者（14.3%，2/14）同時(shí)出現(xiàn)外顯子20 T790M 和外顯子21 L858R 突變;2例患者出現(xiàn)外顯子21 L861Q突變（14.3%，2/14）。

3 ???討論

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）酪氨酸激酶受體抑制劑（tyrosine kinases inhibitors， TKIs）是目前最重要的靶向治療藥物，對(duì)于有EGFR敏感突變的NSCLC，采用EGFR-TKIs治療具有明顯的臨床療效。然而，肺癌組織活檢樣本具有局限性，如很多高齡患者診斷時(shí)已無(wú)法手術(shù)因而無(wú)標(biāo)本可取，氣管鏡取材小，某些腫瘤解剖位置及肺部基礎(chǔ)疾病不適和穿刺，穿刺本身諸多風(fēng)險(xiǎn)，反復(fù)取材患者接受程度低等?！耙后w腫瘤學(xué)檢測(cè)”因其操作可行性強(qiáng)、侵害性小、具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)等特點(diǎn)正越來(lái)越受到臨床關(guān)注。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA） 是凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞直接釋放到外周血中的DNA 片段，并攜帶腫瘤組織相關(guān)信息。朱毅等報(bào)道NSCLC 患者外周血EGFR突變與組織中EGFR突變的一致率為92%。研究發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定及石蠟包埋技術(shù)對(duì)樣本DNA 的會(huì)產(chǎn)生一定的影響，每個(gè)樣本腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與形態(tài)和取樣的位置及大小存在很大關(guān)系，加上腫瘤異質(zhì)性，導(dǎo)致腫瘤病理組織活檢可能不能反映整個(gè)病灶的完整信息。外周血中的ctDNA 來(lái)源于腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶壞死凋亡的腫瘤細(xì)胞碎片，這就可能可以避免腫瘤組織的遺傳異質(zhì)性而體現(xiàn)整個(gè)腫瘤的遺傳學(xué)特征。研究表明在中國(guó)EGFR 基因的突變存在顯著的地域差異，臺(tái)灣地區(qū)的EGFR 基因的突變以外顯子21 為主，云南和廣東地區(qū)以外顯子19 為主。云南宣威是肺癌高發(fā)的地區(qū)，其EGFR基因外顯子18 G719X、外顯子20 S768I突變相對(duì)較高。

本研究檢測(cè)云南地區(qū)37例NSCLC 患者血漿EGFR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變陽(yáng)性14例，突變率37.8%，同文獻(xiàn)報(bào)道相符。本研究結(jié)果顯示，云南地區(qū)NSCLC 患者中，EGFR 基因的突變主要發(fā)生在21 號(hào)外顯子L858R 突變及19 號(hào)外顯子缺失，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究中20號(hào)外顯子S761I無(wú)獨(dú)立突變，與18外顯子G719X伴隨存在，突變率為14.3%，這與楊長(zhǎng)紹等人報(bào)道的云南宣威地區(qū)非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中EGFR基因突變結(jié)果一致，原因是因?yàn)楸狙芯窟x取的云南地區(qū)標(biāo)本包括了云南宣威地區(qū)，只是由于標(biāo)本量相對(duì)較少，進(jìn)行區(qū)域劃分意義不大。Jian 等對(duì)56 例晚期NSCLC 患者血樣本檢測(cè)EGFR突變的檢出率為23.2%，并認(rèn)為血中檢測(cè)到的EGFR突變可以用于預(yù)測(cè)吉非替尼的治療療效。Liu等對(duì)比了不同方法檢測(cè)血漿樣本與組織樣本EGFR 突變的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)與組織樣本相比，血漿的靈敏度67.5%（ 27/40），特異性為100%（ 46/46）。Kim 等對(duì)57 例配對(duì)樣品的組織和血漿分別進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)，血漿樣本和組織樣本EGFR突變狀態(tài)的一致率87.7%。

綜上所述，應(yīng)用ARMS方法檢測(cè)外周血中腫瘤細(xì)胞的EGFR基因突變，可以較準(zhǔn)確地反映NSCLC患者的EGFR突變情況，而且耗時(shí)短，損傷小，標(biāo)本易得且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，是值得臨床推廣。但由于ctDNA的含量非常少，通過(guò)外周血檢測(cè)EGFR突變?nèi)杂幸欢ǖ木窒扌?。雖然一次檢測(cè)外周血EGFR突變陰性，但不說(shuō)明實(shí)體腫瘤細(xì)胞的EGFR突變也是陰性，多次檢測(cè)中任何一次突變陽(yáng)性都可以成為臨床使用EGFR-TKI的依據(jù)。但由于外周血樣本存在假陰性的可能，組織標(biāo)本存在腫瘤異質(zhì)性等特點(diǎn)，因此，我們建議在送檢時(shí)應(yīng)進(jìn)行多種標(biāo)本兼顧。

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