陳曦 劉忠泉 王彬 朱慧 付雷 李媛媛 陸宇

結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并繁殖，憑借在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的特性逃逸機(jī)體免疫防御作用。治療結(jié)核分枝桿菌感染的關(guān)鍵是選用具有良好抗菌活性并且能在巨噬細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效抑菌濃度的藥物。因此，在評(píng)估一種藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否有效時(shí)，不僅要評(píng)估其細(xì)胞外抗菌活性，也要評(píng)估其細(xì)胞內(nèi)抗菌活性。為提高耐藥結(jié)核病治療的有效性，圍繞新的藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)是抗結(jié)核新藥研發(fā)的第一步，也是關(guān)鍵步驟；其中抗結(jié)核藥物細(xì)胞內(nèi)抗菌活性是進(jìn)行體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。本研究針對(duì)目前開(kāi)發(fā)的新型抗結(jié)核藥物，以及臨床上應(yīng)用的抗結(jié)核藥物進(jìn)行了巨噬細(xì)胞內(nèi)抗菌活性比較，并且對(duì)抗結(jié)核藥物的胞內(nèi)濃度進(jìn)行了分析，評(píng)價(jià)體外巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性測(cè)定對(duì)新藥篩選的作用。

材料和方法

一、儀器與材料

1. 儀器：高效液相色譜-質(zhì)譜工作站(UPLC-MS/MS分析系統(tǒng)，由Agilent1290高效液相色譜儀和Agilent6460質(zhì)譜檢測(cè)器組成，安捷倫科技有限公司，美國(guó))、Thermo Fisher低溫離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó))、METTLER-TOLEDO電子分析天平(梅特勒-托利多集團(tuán)公司，瑞士)、Milipore 超純水機(jī)(默克密理博科技有限公司，美國(guó))、二級(jí)生物安全柜(藝思高科技有限公司，新加坡)、二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó))、Tecan Infinite 200酶標(biāo)儀(帝肯集團(tuán)公司，瑞士)。

2. 試劑與材料：0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco生命科技有限公司，美國(guó))、Middlebrook 7H9 (BD 生物科技有限公司，美國(guó))、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水、0.1% SDS裂解液、Middlebrook 7H10 (BD 生物科技有限公司，美國(guó))、OADC增菌液(BD 生物科技有限公司，美國(guó))、色譜純甲醇、色譜純乙腈、超純水。

3. 實(shí)驗(yàn)藥物：利福平(RFP，Sigma，BCBP4553V)、異煙肼(INH，Sigma，MKBV9495V)、左氧氟沙星(Lfx，Sigma，BCBF7004V)、吡嗪酰胺(PZA，Sigma，031M1778V)、貝達(dá)喹啉(TMC207，上海瀚香生物科技有限公司，843663-66-1)、硝基咪唑類(lèi)藥物PA-824(Sigma，187235-37-6)、利奈唑胺(LZD，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、氯苯吩嗪(CFZ，上海瀚香生物科技有限公司，2030-63-9)、苯并噻嗪酮類(lèi)藥物PBTZ-169和BTZ-043(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、利奈唑胺同類(lèi)藥物OTB-658(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、氯苯吩嗪衍生物TBI-166(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、TZY-5-84(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所)、NTB-3119H(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

4. 細(xì)胞與菌株：J774.1 巨噬細(xì)胞(購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)、結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 27294，北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室凍存)。

二、 實(shí)驗(yàn)方法

本研究于2018年9月至2019年3月測(cè)定了14種抗結(jié)核藥物的最低抑菌濃度和巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性；并測(cè)定了其中8種抗結(jié)核藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。

(一)最低抑菌濃度測(cè)定

采用微孔培養(yǎng)顯色法(MABA法)測(cè)定90%最低抑菌濃度(MIC90)。

(1) 結(jié)核分枝桿菌單菌落懸液制備：結(jié)核分枝桿菌H37Rv接種于含10% OADC、0.05%吐溫-80的7H9液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2～3周至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 μm濾膜過(guò)濾細(xì)菌懸液，獲得單菌懸液，菌液經(jīng)10倍稀釋后接種于7H10固體培養(yǎng)基，4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定單菌懸液的濃度(CFU/ml)(CFU：菌落形成單位)。(2)藥物的制備及菌液接種：取無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，第1排前6孔加入200 μl 7H9培養(yǎng)基，設(shè)為陰性對(duì)照孔，后6孔加入100 μl 7H9培養(yǎng)基和等體積的單菌落懸液，設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照孔；除第1排外，其余各排第1列分別加入含有實(shí)驗(yàn)藥物(RFP、INH、Lfx、PZA、TMC207、CFZ、LZD、PA-824、TBI-166、OTB-658、PBTZ-169、BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H)的7H9培養(yǎng)基200 μl，剩余各孔分別加入100 μl 7H9培養(yǎng)基，從第1列吸取100 μl含藥培養(yǎng)基加入第2列，依次連續(xù)倍比稀釋至最后一列。然后在除陰性對(duì)照孔之外的各孔中加入制備好的單菌落懸液100 μl，使每孔中最終培養(yǎng)容積均為200 μl，菌液終濃度為4×105CFU/ml。(3)孵育條件：37 ℃培養(yǎng)7 d。(4) 加入顯色試劑：在已培養(yǎng)7 d的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入Alamar Blue 20 μl，20% 吐溫-80 12.5 μl，混合均勻(避光操作)。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。(5)結(jié)果判讀：應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，并計(jì)算MIC90。

(二)巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核藥物活性測(cè)定

(1)J774.1單核巨噬細(xì)胞的制備：在75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至占培養(yǎng)皿面積的80% 時(shí)，以0.25% 胰蛋白酶2 ml室溫消化1 min，棄去胰酶后加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打貼壁巨噬細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/ml，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1 ml細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育16 h，貼壁細(xì)胞用于結(jié)核分枝桿菌的感染。(2)結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將結(jié)核分枝桿菌凍存菌液稀釋為2×106CFU/ml的細(xì)菌懸液。向孵育貼壁巨噬細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1 ml/孔的細(xì)菌懸液，即感染復(fù)數(shù)為5∶1；37 ℃孵育3 h，吸棄含菌培養(yǎng)基，用無(wú)菌1×PBS洗滌2次，以除去胞外結(jié)核分枝桿菌。(3)實(shí)驗(yàn)藥物的制備及處理細(xì)胞：精密稱(chēng)取14種抗結(jié)核藥物RFP、INH、Lfx、PZA、TMC207、CFZ、LZD、PA-824、TBI-166、OTB-658、PBTZ-169、BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H，用二甲基亞砜(DMSO)或超純水溶解并定容為1 mg/ml。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋待測(cè)藥物，終濃度設(shè)為5、2和0.50 μg/ml。向含有已感染結(jié)核分枝桿菌的貼壁巨噬細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中加入新鮮配制的含有不同濃度實(shí)驗(yàn)藥物的培養(yǎng)基，2 ml/孔，37 ℃孵育72 h。并設(shè)不經(jīng)藥物處理的陰性對(duì)照孔，所有試驗(yàn)孔均設(shè)復(fù)孔。(4)巨噬細(xì)胞的裂解及細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌計(jì)數(shù)：藥物處理貼壁巨噬細(xì)胞72 h后，吸棄含藥培養(yǎng)基，向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入200 μl 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，37 ℃ 靜置5 min以裂解細(xì)胞，隨后各孔中加入800 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，中和裂解，裂解液混勻后用生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋。分別取100 μl不同濃度的稀釋液接種到7H10固體培養(yǎng)板上，37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)3～4周，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

(三)巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核藥物濃度測(cè)定

(1)J774.1單核巨噬細(xì)胞的制備：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，在直徑9 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入10 ml細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)量為1×107個(gè)/培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育16 h，吸棄培養(yǎng)基，貼壁細(xì)胞用于藥物處理及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度。(2)藥物的制備與處理巨噬細(xì)胞：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋待測(cè)的8種抗結(jié)核藥物RFP、INH、Lfx、TMC207、CFZ、LZD、TBI-166、PBTZ-169，終濃度分別為20、10和5 μg/ml。向孵育貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入10 ml各濃度的含藥培養(yǎng)基，藥物處理細(xì)胞3 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，加入1×PBS洗滌1次，以去除細(xì)胞外藥物。所有試驗(yàn)均設(shè)不經(jīng)藥物處理的陰性對(duì)照，脂溶性藥物RFP、TMC207、CFZ和抗結(jié)核新化合物TBI-166、PBTZ-169測(cè)定試驗(yàn)中設(shè)置藥物處理的0 h對(duì)照。(3)收集細(xì)胞及待測(cè)樣品：向藥物處理后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2 ml的0.25% 胰蛋白酶，消化20 s；隨后加入3 ml 新鮮培養(yǎng)基中和胰酶，吹打貼壁細(xì)胞使其懸浮，收集細(xì)胞懸液，4 ℃ 100×g離心5 min，棄去培養(yǎng)基，每份細(xì)胞樣品加入1 ml去離子水，重懸細(xì)胞后4 ℃放置1 h，經(jīng)鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞完全裂解。細(xì)胞裂解液4 ℃ 2000×g離心10 min，留取沉淀加入1 ml去離子水混勻，同時(shí)留取上清液。不經(jīng)含藥培養(yǎng)基孵育的細(xì)胞陰性對(duì)照樣品收集方法同上。(4)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測(cè)定藥物濃度：巨噬細(xì)胞內(nèi)藥物濃度測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)[1-2]。取未經(jīng)藥物處理的空白細(xì)胞裂解液分別稀釋實(shí)驗(yàn)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，分別制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。各取上一步中收集的離心沉淀懸液和上清液樣品200 μl加入等體積的乙腈，充分混勻， 4 ℃ 13 800×g離心10 min，收集上清進(jìn)行質(zhì)譜分析。色譜條件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)藥物選擇甲醇-甲酸銨水溶液(含5 mmol/L 甲醇和0.1%甲酸；85∶15, v/v)或乙腈-甲酸銨水溶液(含5 mmol/L 乙腈和0.1%甲酸；8∶92,v/v)為流動(dòng)相，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱[2.1 mm×100 mm,3.5 μm(柱子直徑2.1 mm，長(zhǎng)度100 mm，柱子中硅膠填料粒徑3.5 μm)]，流率為0.2 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μl；質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為正離子模式，選擇多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)方式掃描。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

CFU計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換為lg(CFU/ml)，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行區(qū)組資料的多因素方差分析，比較各藥物處理組與未經(jīng)藥物處理組間巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的lg(CFU/ml)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MIC90測(cè)定

藥物的胞外MIC90見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，胞外抗結(jié)核活性最強(qiáng)的藥物為苯并噻嗪類(lèi)的PBTZ-169和BTZ-043，其MIC90分別低至0.0005 μg/ml和0.002 μg/ml?？菇Y(jié)核活性最弱的為PZA，其MIC90高達(dá)200 μg/ml。

二、 巨噬細(xì)胞內(nèi)藥物的抗結(jié)核活性檢測(cè)

受試藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)的抗結(jié)核活性數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。 RFP、INH、Lfx、TMC207、PA-824、CFZ、TBI-166、NTB-3119H、LZD、TZY-5-84、PBTZ-169和BTZ-043呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)基中藥物濃度為0.50 μg/ml時(shí)，INH、PBTZ-169、TMC207、BTZ-043、NTB-3119H、TZY-5-84、PA-824分別降低巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌1.60、1.33、1.31、1.25、1.13、1.01 和1.00 lg(CFU/ml)；細(xì)胞培養(yǎng)基中藥物濃度為2 μg/ml時(shí)，INH、PBTZ-169、TMC207、CFZ、NTB-3119H、BTZ-043、TZY-5-84、Lfx、PA-824分別降低巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌2.18、1.91、1.65、1.55、1.47、1.44、1.29、1.24和1.15 lg(CFU/ml)；細(xì)胞培養(yǎng)基中藥物濃度為5 μg/ml時(shí)，PBTZ-169、NTB-3119H、INH、CFZ、TMC207、PA-824、TZY-5-84、BTZ-043、RFP、Lfx和TBI-166分別降低巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌4.78、2.48、2.33、2.09、1.91、1.48、1.48、1.46、1.44、1.37 和1.34 lg(CFU/ml)。胞內(nèi)活性最強(qiáng)的為INH、PBTZ-169和TMC207，其中PBTZ-169在5 μg/ml時(shí)，顯示出了完全的殺菌活性；與其他抗結(jié)核藥物相比，同屬一類(lèi)的LZD和OTB-658的胞內(nèi)抗結(jié)核活性弱，PZA的胞內(nèi)抗結(jié)核活性微弱。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)基中各種藥物在不同濃度時(shí)巨噬細(xì)胞內(nèi)單菌懸液的濃度和體外MIC90值

注5 μg/ml、2 μg/ml、0.5 μg/ml、0 μg/ml為培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基中的藥物濃度；陰性對(duì)照為培養(yǎng)孔內(nèi)的巨噬細(xì)胞在不含藥物的同等容積細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；“-”：無(wú)值。lg(CFU/ml)降低值=陰性對(duì)照單菌懸液的lg(CFU/ml)均值(4.78)—培養(yǎng)基中不同藥物濃度時(shí)巨噬細(xì)胞內(nèi)單菌懸液的lg(CFU/ml)均值

三、抗結(jié)核藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)濃度分析

藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)的濃度見(jiàn)表2。為排除脂溶性藥物RFP、TMC207、CFZ和抗結(jié)核新化合物TBI-166、PBTZ-169 與細(xì)胞壁結(jié)合對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)藥物濃度測(cè)定的影響，筆者測(cè)定了這些藥物和化合物處理細(xì)胞0 h時(shí)細(xì)胞裂解液中的藥物濃度，并以此為基線。在培養(yǎng)基中藥物濃度為5 μg/ml時(shí)，PBTZ-169、TMC207、RFP、CFZ、TBI-166和Lfx在巨噬細(xì)胞內(nèi)的濃度為0.60、0.80、0.48、0.78、0.17和0.37 μg/ml，分別為其MIC90值的1200.00、26.67、9.60、6.50、4.25和1.48倍，且隨著培養(yǎng)基內(nèi)藥物濃度的升高二者比值也相應(yīng)升高。雖然只在培養(yǎng)基含藥濃度為20 μg/ml時(shí)測(cè)出INH的胞內(nèi)濃度，但其與MIC90的比值也高達(dá)5.40倍；與上述幾種藥物相比，LZD 的巨噬細(xì)胞內(nèi)濃度與MIC的比值只在培養(yǎng)基中藥物濃度提高至20 μg/ml時(shí)才升高到1.28倍，這些結(jié)果提示不同的抗結(jié)核藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力存在較大差異，也表明其進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力即細(xì)胞內(nèi)藥物濃度以及與MIC的關(guān)系是細(xì)胞內(nèi)活性的決定因素。

討 論

巨噬細(xì)胞對(duì)于結(jié)核分枝桿菌來(lái)說(shuō)，不僅是逃逸宿主免疫效應(yīng)的避風(fēng)港，而且也是逃避藥物殺傷的屏障。藥物若要對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬的結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮作用，必需經(jīng)過(guò)進(jìn)入巨噬細(xì)胞、溶酶體及結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜的過(guò)程，因此藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞是發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性所必需的。此外，還與各種藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度相關(guān)。本研究評(píng)價(jià)不同作用靶點(diǎn)的14種抗結(jié)核藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)、外的抗結(jié)核活性，以說(shuō)明巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性的作用及相關(guān)性。

表2 8種抗結(jié)核藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)的濃度

注“-”：未測(cè)出或未檢測(cè)；3 h-0 h：3 h與0 h的胞內(nèi)藥物濃度差值；胞內(nèi)藥物濃度/MIC90值：帶a角標(biāo)的數(shù)值與MIC90值的比值

本研究中MABA法測(cè)得的MIC90結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3-4]。筆者發(fā)現(xiàn)LZD和OTB-658的細(xì)胞外抗菌活性(MIC90)與細(xì)胞內(nèi)抗菌活性并不完全一致，其MIC90均較低，但并未表現(xiàn)出良好的胞內(nèi)抗菌活性。其中LZD已應(yīng)用于臨床治療，其在臨床化療中的優(yōu)勢(shì)與其對(duì)細(xì)菌的滅菌活性相關(guān)。上述兩種藥物的體外MIC90結(jié)果和細(xì)胞內(nèi)活性的非對(duì)應(yīng)關(guān)系，提示了藥物的體外MIC90結(jié)果的局限性，也顯示細(xì)胞內(nèi)活性測(cè)定的重要作用；但二者均為體外活性的評(píng)價(jià)方法，藥物活性評(píng)價(jià)必須要進(jìn)行感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥效評(píng)價(jià)，以更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)新藥的抗結(jié)核活性。但對(duì)于PBTZ-169、BTZ-043、TMC207、PA-824來(lái)說(shuō)，其胞內(nèi)、外抗菌活性均表現(xiàn)優(yōu)異，抗結(jié)核活性最佳的PBTZ-169與BTZ-043，二者同屬于苯并噻嗪類(lèi)藥物，BTZ-043的72 h內(nèi)殺菌活性與INH相似，細(xì)菌代謝的最早階段即可被其阻止[5]；PBTZ-169的活性更優(yōu)于BTZ-043，在5 μg/ml時(shí)，表現(xiàn)出完全的胞內(nèi)殺菌活性，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[6-7]。分析其原因：(1)PBTZ-169與BTZ-043具有良好的體外抗結(jié)核活性，MIC90值低；(2)PBTZ-169與BTZ-043均具有進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力并達(dá)到了MIC90值以上。吡嗪酰胺在人體中胞內(nèi)殺菌效果較好，但本研究發(fā)現(xiàn)PZA在體外的細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性比較差，這與Heifets等[8]的研究結(jié)果類(lèi)似；因PZA需要在酸性環(huán)境下才能發(fā)揮抗結(jié)核活性，因此推測(cè)在本研究模型中PZA進(jìn)入巨噬細(xì)胞后尚未被吞噬溶酶體攝取，胞質(zhì)中pH條件不是PZA發(fā)揮殺菌活性的最佳條件。

抗結(jié)核藥物細(xì)胞內(nèi)藥效評(píng)價(jià)涉及因素較多。鄭海琴等[9]之前的研究顯示，感染復(fù)數(shù)、感染時(shí)間和藥物作用時(shí)間均對(duì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性有影響；另外，還發(fā)現(xiàn)感染菌的活力也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此本研究對(duì)上述影響因素進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。用于結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞系常選用RAW264.7和J774.1兩種，相比RAW264.7細(xì)胞，雖然J774.1細(xì)胞傳代后貼壁時(shí)間稍長(zhǎng)，但是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更易保持穩(wěn)定且不易向終末細(xì)胞分化，因此本研究中選用J774.1細(xì)胞系作為感染模型。

抗結(jié)核藥物在巨噬細(xì)胞模型中的細(xì)胞內(nèi)濃度是評(píng)價(jià)其活性的重要內(nèi)容之一。目前，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的方法主要有高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法。本研究采用HPLC-MS-MS方法直接測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。 Baietto等[10]用超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS-MS)方法測(cè)定了EMB、INH、RFP與PZA在患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)內(nèi)的濃度，與本研究相比，這些藥物進(jìn)入PBMC和巨噬細(xì)胞內(nèi)的能力并不相同。

本研究表明，與體外MIC90測(cè)定相比較，藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)的濃度可以體現(xiàn)出藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力，是胞內(nèi)發(fā)揮抗結(jié)核活性的重要因素，也是發(fā)現(xiàn)新藥不同體外活性的一個(gè)重要評(píng)價(jià)內(nèi)容。在臨床治療藥物選擇組成方案時(shí)，要充分考慮各種藥物的抗菌活性與特性，結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)致病菌，選擇能在巨噬細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效抑菌濃度的抗菌藥物，即選擇那些能夠有效滲透進(jìn)入細(xì)胞的抗結(jié)核藥物非常重要。

本研究的局限之處是沒(méi)有采用多種細(xì)胞模型，以及沒(méi)有納入更多的抗結(jié)核藥物。在后續(xù)的研究中，隨著更多藥物的納入，以及針對(duì)各種藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)PK/PD 的研究及細(xì)胞器分布，必將豐富及完善巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核藥物活性研究的理論，并為開(kāi)展后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供幫助。