陳小蘭 鄭道國 徐群威 蘇麗麗

（浙江省臺州市中西醫(yī)結合醫(yī)院，浙江 臺州 317523）

缺血性心臟病嚴重威脅人類健康，其發(fā)病率呈現(xiàn)增長趨勢［1］。通過有效方法使缺血心肌重新獲得血液供應可治療缺血性心臟病，但是血液再灌注會加劇原有心肌缺血性損傷，即發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）［2］。近年來，中醫(yī)藥對MI/RI保護作用的研究是中西醫(yī)結合研究的切入點之一，采用中藥有效成分提取物或中藥復方對于治療MI/RI具有較好的療效［3］。因此，系統(tǒng)地篩選能有效治療該病的中草藥，并研究其作用機制，可發(fā)掘傳統(tǒng)中藥方劑的臨床實用價值，推動中藥科學內涵的發(fā)展。南葶藶子是十字花科植物播娘蒿的干燥成熟種子，在臨床中多用于治療心力衰竭、肺水腫等疾病，療效明顯［4］。研究發(fā)現(xiàn)，南葶藶子提取液可改善心力衰竭大鼠各項心功能指標，保護心肌損傷［5］。目前，南葶藶子提取液對MI/RI發(fā)生時心肌自噬的影響還未見報道。本研究通過建立MI/RI大鼠模型，觀察南葶藶子提取液對MI/RI大鼠心肌自噬的影響并探討其可能的作用機制，以期為進一步地治療相關心臟疾病的新藥研發(fā)提供一定實驗依據?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 72只健康成年雄性SD大鼠，SPF級，體質量160～240 g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。大鼠飼養(yǎng)條件：光照12 h，室溫25～28℃，相對濕度45%，自由飲水和進食。

1.2 試藥與儀器 南葶藶子水提液：取100 g南葶藶子，加入4倍量蒸餾水，70℃水浴提取3次，每次提取1 h，合并濾液濃縮至100 mL備用，每1毫升相當于2 g原生藥，實驗時用0.9%氯化鈉注射液配成所需濃度。果糖二磷酸鈉注射液，北京華靳制藥有限公司，國藥準字H20013086。乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。LC3Ⅰ和LC3Ⅱ抗體，美國Epitomics公司，貨號分別為ab52768、ab51739。Beclin-1抗體，美國CST公司，貨號D40C5。兔抗鼠B淋巴細胞瘤（Bcl-2）多克隆抗體（批號Nosc-509）。蛋白激酶p38（p38）抗體，美國CST公司，貨號D31C7。細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）和p-ERK1/2抗體，美國Cell Signaling Technology，批號分別為SC365058、SC365062。β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。JEM-1011透射電子顯微鏡，日本。

1.3 分組與給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、陽性對照組及南葶藶子提取液低、中、高劑量組。陽性對照組，按劑量100 mg/kg尾靜脈緩慢注射果糖二磷酸鈉［5］。南葶藶子水提液低、中、高劑量組分別按劑量5、10、20 g/（kg·d）尾靜脈緩慢注射南葶藶子水提液［6］。假手術組和模型組尾靜脈注射100 mg/kg 0.9%氯化鈉注射液。連續(xù)給藥3周。

1.4 模型制備 末次給藥結束后，參照文獻方法建立MI/RI模型，大鼠于術前12 h禁食，麻醉后固定四肢，并切開氣管與動物呼吸機相連接，逐步分離肌肉組織后找到冠狀動脈左前降支，在分支起點約1～2 mm處采用5-0號絲線結扎，心電圖中的ST段抬高、缺血心肌區(qū)域的心肌壁發(fā)紺、膨出，表明MI形成。結扎30 min后松開，將胸腔關閉再灌注120 min，心電圖中的ST段回落＞1/2，表明MI/RI模型成功建立［7］。假手術組只開胸不結扎。

1.5 標本采集與檢測 1）血清LDH、CK-MB和cTnⅠ檢測。大鼠再灌注120 min后腹主動脈取血，4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明檢測上清液中CK-MB、LDH和cTnⅠ含量。2）心肌組織HE染色。大鼠取血后，迅速剪取心臟，預冷0.9%氯化鈉注射液沖洗。取適量心肌組織固定于10%甲醛溶液中，經脫水、包埋制成石蠟切片，蘇木精和伊紅染色，光學顯微鏡觀察。剩余心肌組織-80℃保存?zhèn)溆谩?）心肌組織自噬小體觀察。參照文獻［8］方法，取心肌組織，2.5%戊二醛固定4 h，清洗后用鋨酸固定2 h，經丙酮脫水、丙酮與包埋劑浸透、Epon 812樹脂包埋，超薄切片。用醋酸鈾、硝酸鉛雙染色20 min，透射電鏡觀察。4）心肌組織MDA和SOD檢測。取心肌組織稱質量，制成心肌組織勻漿，4℃、3 500 r/min離心15 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明檢測上清液中MDA和SOD含量。5）心肌組織蛋白檢測。采用Western blotting法測定心肌組織Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2、p38和p-ERK1/2蛋白表達水平。取心肌組織剪碎，加入RIPA裂解液置于冰上充分裂解，離心取上清液，BCA法測定蛋白含量。取適量蛋白，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將分離的蛋白質轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜。洗膜后，加入二抗室溫孵育1 h。經ECL發(fā)光顯影后，以β-actin為內參，用SensiAnsys凝膠系統(tǒng)分析其灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 各組大鼠心電圖比較 見圖1，表1。與假手術組比，模型組大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠心電圖ST段降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，南葶藶子提取液低、中劑量組大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05）。南葶藶子不同劑量組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.017，P＜0.05），心電圖ST段隨劑量增加呈下降趨勢。

圖1 各組大鼠心電圖變化

表1 各組大鼠心電圖ST段比較（mV，±s）

表1 各組大鼠心電圖ST段比較（mV，±s）

與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術組模型組陽性對照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組n 12 12 12 12 12 12 ST段0.18±0.05 0.57±0.11#0.31±0.07*0.49±0.10△0.41±0.09*△0.33±0.07*

2.2 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比較 見表2。與假手術組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠血清LDH、CKMB和cTnⅠ均降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，南葶藶子提取液低、中劑量組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高，且南葶藶子提取液高劑量組大鼠血清CK-MB降低（P＜0.05）。南葶藶子不同劑量組之間比較具有統(tǒng)計學意義（F=1596.089、1390.122、33.028，P＜0.05），血清LDH、CK-MB和cTnⅠ隨劑量增加呈下降趨勢。

表2 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比較（±s）

表2 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比較（±s）

組 別n LDH（U/L）CK-MB（U/L）cTnⅠ（ng/L）假手術組模型組陽性對照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組12 12 12 12 12 12 863.25±23.17 1 933.47±61.52#950.72±32.48*1 891.54±50.26△1 429.18±38.46*△947.62±31.93*1 539.17±40.28 3 769.24±133.57#1 765.29±43.85*3 659.26±128.46△2 573.18±81.92*△1 698.27±42.19*△27.35±3.68 68.29±11.59#32.85±3.91*60.19±10.25△47.28±7.93*△34.18±4.05*

2.3 各組心肌組織病理學變化 見圖2。假手術中組心肌細胞大小均勻，邊界清晰。模型組大鼠心肌壞死，出現(xiàn)水腫，中性粒細胞浸潤，和輕度炎癥，心肌細胞排列不規(guī)則，細胞間隙增大。陽性對照組心肌細胞排列規(guī)整，細胞界限較為清晰，染色均勻。經南葶藶子提取液干預后，隨著劑量增加心肌病變緩解，壞死、炎癥細胞浸潤和心肌水腫明顯減少，心肌細胞排列更為規(guī)整。

圖2 心肌組織病理學變化（200倍）

2.4 心肌組織自噬小體觀察 見圖3。假手術組心肌細胞細胞膜完整，細胞器形態(tài)正常。模型組大鼠心肌組織線粒體腫脹，出現(xiàn)大量自噬小體，空泡變性嚴重。陽性對照組的自噬小體數(shù)量較少，且心肌細胞細胞膜較為完整。南葶藶子提取液組大鼠心肌組織隨著劑量增加，線粒體腫脹程度不斷減輕，自噬小體數(shù)量不斷減少。

圖3 各組心肌組織超微結構觀察（400倍）

2.5 各組大鼠心肌組織MDA和SOD水平比較 見表3。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織MDA含量升高（P＜0.05），SOD活力降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠心肌組織MDA含量降低（P＜0.05），SOD活力升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，南葶藶子提取液低、中劑量組大鼠心肌組織MDA含量升高，SOD活力降低（P＜0.05）。南葶藶子不同劑量組之間比較具有統(tǒng)計學意義（F=395.481、322.516，P＜0.05），其中心肌組織MDA含量隨劑量增加呈下降趨勢，SOD活力隨劑量增加呈上升趨勢。

表3 各組大鼠心肌組織MDA和SOD水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織MDA和SOD水平比較（±s）

組別假手術組模型組陽性對照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組n 12 12 12 12 12 12 MDA（nmol/mg）3.29±0.38 19.57±1.53#5.29±0.47*17.23±1.49△11.28±0.87*△5.41±0.45*SOD（U/mg）185.27±11.34 79.25±5.26#160.73±10.51*83.46±5.79*△128.71±7.18*△163.49±9.73*

2.6 各組自噬相關蛋白和MAPK/ERK1/2通路相關表達比較 見圖4、表4。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05），Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠心肌組織Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P＜0.05），Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表達升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，南葶藶子提取液低劑量組Beclin-1、p38及南葶藶子提取液不同劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，南葶藶子提取液低劑量組Bcl-2及南葶藶子提取液低、中劑量組p-ERK1/2降低（P＜0.05），南葶藶子不同劑量組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-ERK1/2、p38之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=21.977、82.006、39.661、23.607，P＜0.05），其中B-eclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值隨劑量增加呈下降趨勢，p-ERK1/2蛋白表達隨劑量增加呈上升趨勢。

圖4 自噬和MAPK/ERK1/2通路相關蛋白表達條帶

表4 各組自噬和MAPK/ERK1/2通路相關蛋白相對表達水平比較（±s）

表4 各組自噬和MAPK/ERK1/2通路相關蛋白相對表達水平比較（±s）

組別假手術組模型組陽性對照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組n 12 12 12 12 12 12 Beclin-1 0.34±0.12 1.09±0.27#0.45±0.18*0.98±0.26△0.53±0.21*0.43±0.17*LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.20±0.10 1.96±0.25#0.34±0.13*1.86±0.24△1.33±0.21*△0.74±.19*△Bcl-2 0.96±0.25 0.28±0.10#0.49±0.21*0.29±0.13△0.37±0.16*0.45±0.19*p-ERK1/2 0.91±0.23 0.18±0.08#0.87±0.21*0.23±0.09△0.43±0.17*△0.79±0.19*p38 0.28±0.11 0.85±0.21#0.34±0.13*0.81±0.20△0.42±0.17*0.37±0.14*

3討論

MI/RI可增加心肌細胞膜通透性，導致心肌內細胞酶釋放進入血液，因此，血清心肌酶可用于判斷心肌損傷的嚴重程度［9］。血清LDH、CK-MB和CTnⅠ是臨床上常用的心肌損傷標志物。本研究結果顯示，MI/RI大鼠心電圖ST段顯著抬高，心肌組織細胞排列不整齊，出現(xiàn)水腫、炎癥等現(xiàn)象，LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高，說明MI/RI大鼠心肌細胞受到損傷。南葶藶子提取液干預后，心肌組織水腫、炎癥等現(xiàn)象得到改善，LDH、CK-MB和cTnⅠ降低，說明其可減輕MI/RI對細胞膜的損傷，降低心肌酶釋放，發(fā)揮心肌保護作用。

自噬是溶酶體降解細胞內部分細胞質、細胞器等過程的統(tǒng)稱，可維持心肌細胞形態(tài)、結構和功能。心肌缺血再灌注引起機體產生氧化應激，氧化應激過程中生成的活性氧可誘導自噬產生［10］。氧化應激發(fā)生時，過量的氧自由基攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸使其脂質過氧化。MDA作為脂質過氧化產物，其含量越高，說明心肌組織損傷越嚴重。SOD是重要的抗氧化酶，可有效清除自由基，減輕自由基對心肌細胞或組織的損傷。本研究結果顯示，南葶藶子提取液可降低MI/RI大鼠心肌組織MDA含量，提高SOD活力，提示南葶藶子提取液可通過降低氧化應激減輕自噬對MI/RI大鼠心肌損傷。Beclin-1在自噬過程中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用，其水平高低可反映自噬活性［11］?？沟蛲龅鞍譈cl-2可與Beclin-1結合調控機體自噬水平［12］。細胞自噬發(fā)生過程中，LC3Ⅰ被剪切為LC3Ⅱ，LC3Ⅱ參與細胞自噬泡的形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬被激活的程度［13］。本研究結果顯示，南葶藶子提取液干預可降低MI/RI大鼠心肌組織自噬小體數(shù)量，Beclin-1蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，促進Bcl-2蛋白表達，提示南葶藶子提取液可通過降低MI/RI大鼠心肌自噬，減輕心肌損傷。

缺血/再灌注過程引起心肌細胞凋亡。絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路（MAPKs）是重要的細胞凋亡調控通路，主要包括p38和ERK1/2等通路。p38通路的激活促進細胞凋亡，而ERK1/2信號通路的激活可抑制細胞凋亡，增加調控。p38和ERK1/2信號通路參與心肌缺血/再灌注過程，影響心肌組織正常功能［14］。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織p38蛋白水平升高，p-ERK1/2蛋白水平降低，與相關報道結果一致［15］。南葶藶子提取液干預后，p38蛋白隨劑量增加呈下降趨勢，p-ERK1/2蛋白表達隨劑量增加呈上升趨勢，提示南葶藶子提取液可能通過作用p38和ERK1/2信號通路減輕MI/RI。

綜上所述，南葶藶子提取液可減輕心肌缺血/再灌注大鼠心肌自噬，保護心肌損傷，其作用機制可能與p38和ERK1/2信號通路有關。