趙瑞鵬 李志強(qiáng) 顧曉東 韓鵬飛 李鵬翠 李春江 王小虎 段王平 衛(wèi)小春**

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，太原 030001；2.呂梁市人民醫(yī)院骨科，山西呂梁 033000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨慢性退變和繼發(fā)關(guān)節(jié)軟骨骨化為主要病理變化，關(guān)節(jié)間隙漸進(jìn)性狹窄、骨贅形成及關(guān)節(jié)脹痛、活動(dòng)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的疾病[1,2]。隨著社會(huì)快速發(fā)展，車禍、建筑摔傷、體育競(jìng)技等高能量外傷事故不斷增多，臨床上半月板損傷、交叉韌帶撕裂、髕骨骨折以及隨之而來的OA患者也逐漸增多。調(diào)查表明，至2020年OA可能成為全球第四大致殘疾病，給個(gè)人及國(guó)家?guī)沓林氐呢?fù)擔(dān)[3,4]。

膝關(guān)節(jié)是由股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端、髕骨內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面及周圍韌帶、肌肉包裹構(gòu)成的作用關(guān)鍵、功能復(fù)雜的承重關(guān)節(jié)，同時(shí)也是OA重要的病變部位[5,6]。傳統(tǒng)OA動(dòng)物模型制備手術(shù)主要包括前交叉韌帶切斷術(shù)（anterior cruciate ligament transection,ACLT）、前交叉韌帶重建術(shù)（anterior cruciate ligament reconstruction,ACLR）、半月板失穩(wěn)術(shù)（destabilization of the medial meniscus,DMM）、髕骨脫位術(shù)（patella dislocation）等，制備的脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)、股骨內(nèi)側(cè)髁、髕骨關(guān)節(jié)等單一間室OA模型都不能很好地模擬臨床發(fā)病率較高的多間室OA病變特征[7-9]。由此，本課題組采用巴馬小型豬建立ACLR聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備多間室OA模型。豬的生理特征、體液生化指標(biāo)、骨質(zhì)結(jié)構(gòu)更加接近人類。與鼠、兔、羊相比，豬軟骨組織中的膠原纖維排列更接近人軟骨。同時(shí)，由于圈養(yǎng)豬體格較大、攝食較多，不方便管理和手術(shù)操作。本課題組采用心血管、消化、泌尿、皮膚、口腔等學(xué)科常用的巴馬小型豬制備多間室OA模型[10,11]。此外，步態(tài)分析研究已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12]。

本實(shí)驗(yàn)利用巴馬小型豬，建立ACLR聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備多間室OA病變模型，通過步態(tài)分析儀收集步態(tài)數(shù)據(jù)，旨在評(píng)估髕骨脫位狀態(tài)下多間室OA的步態(tài)特征，揭示多間室0A病變的影響因素，幫助OA 患者早期臨床診斷、治療及康復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18月齡健康雌性巴馬小型豬6只，體重（41.6±3.5）kg，購于北京市實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地[許可證號(hào)SCXX(jing)2013-0008]。飼養(yǎng)于中國(guó)輻射防護(hù)研究院[許可證號(hào)SYXK(Jin)2016-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

舒泰50（virbac S.A），前交叉韌帶重建導(dǎo)向器（Arthrex，Inc.），軟骨環(huán)鉆（MOC Medizinische Gerate Gmbh，?8 mm），超聲脫鈣儀（VCare）步態(tài)分析儀器：Tekscan walkway.v.7.6x（Tekscan，Inc.307 West First Street，South Boston，MA 02127）。

1.3 動(dòng)物模型的制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12 h禁食，稱體重，舒泰50肌內(nèi)注射麻妥（1 ml/15 kg），左側(cè)臥位，右后肢（right hind,RH）膝關(guān)節(jié)剃毛備皮，碘伏消毒，鋪巾。

手術(shù)造模過程如圖1所示。取右后肢髕骨外側(cè)切口，以髕骨外緣2 cm為中心縱向切“S”形切口，長(zhǎng)約8 cm，逐層切開膝關(guān)節(jié)外側(cè)支持帶和部分股四頭肌，切開關(guān)節(jié)囊，向內(nèi)側(cè)推開髕骨使其內(nèi)脫位，顯露膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶。前交叉韌帶重建導(dǎo)向器鉤住韌帶股骨止點(diǎn)端與縱軸線成45°，插入克氏針套筒固定?？招你@（內(nèi)徑0.8 cm）以克氏針套筒為圓心從股骨外側(cè)髁外面鉆向前交叉韌帶附著處，鉆透前（深約1.8 cm）停止空心鉆，防止韌帶從股骨止點(diǎn)處斷裂。克氏針（直徑1 mm）沿著孔道外圍不斷穿透，保證空心鉆鉆取得到的骨柱帶著前交叉韌帶完整分離。穿透后，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)推出骨柱檢查前交叉韌帶完整附著于骨柱，附著前交叉韌帶的骨柱沿空心鉆骨道回退，恢復(fù)原位，2根克氏針（直徑1.5 mm）從股骨外側(cè)髁外面（空心鉆鉆口處）斜穿交叉固定骨柱徹底沖洗傷口，髕骨內(nèi)脫位狀態(tài)下部分縫合外側(cè)關(guān)節(jié)囊，手法屈伸膝關(guān)節(jié)觀察髕骨運(yùn)動(dòng)軌跡并保證髕骨不能復(fù)位于股骨滑車溝內(nèi)，關(guān)節(jié)囊外層逐層縫合。術(shù)后行X線檢查，確保模型制備成功（圖2）。左后肢（left hind,LH）不做任何處理作為正常對(duì)照。

1.4 步態(tài)數(shù)據(jù)的采集

為了排除動(dòng)物個(gè)體行走、學(xué)習(xí)技能之間的差異。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前10 d開始步態(tài)訓(xùn)練，全程勻速、正常步態(tài)通過步態(tài)分析儀記錄1 次（圖3），每只動(dòng)物每天成功記錄5次，連續(xù)訓(xùn)練10 d。術(shù)前（圖4），術(shù)后7、15、30、45、60、75、90 d 采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物步態(tài)數(shù)據(jù)，具體包括：體重（body weigth,BW）、后肢負(fù)重（%BW）、后肢觸地面積（cm2）、后肢觸地沖量（%BW·s）、后肢足底局部最大壓力（%BW）、后肢擺動(dòng)相時(shí)間（s）、后肢支撐相時(shí)間（s）。為減小誤差，排除個(gè)體差異，負(fù)重指標(biāo)采用自身BW%表示。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄5次。

1.5 病理觀察

術(shù)后3 個(gè)月安樂處死所有動(dòng)物，髖關(guān)節(jié)離斷，獲取LH 和RH。打開膝關(guān)節(jié)囊，應(yīng)用環(huán)鉆在股骨滑車處鉆取骨柱。骨柱在4%多聚甲醛固定48 h 后，超聲脫鈣儀中浸泡脫鈣10周。骨柱依次脫水、浸蠟、切片（6 μm），番紅“O”染色，光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 手術(shù)造模過程

圖2 造模后RH正位（A）、側(cè)位（B）X線檢查顯示髕骨處于內(nèi)脫位狀態(tài)

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物步態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均符合偏態(tài)分布，采用M（QR）表示。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)法比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH步態(tài)數(shù)據(jù)差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無麻醉意外，術(shù)后6 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒，無感染與死亡，切口愈合良好。

2.2 后肢負(fù)重結(jié)果

圖3 巴馬小型豬邁步模式圖

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH 與LH 負(fù)重基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后RH 負(fù)重明顯降低，LH 負(fù)重有所增加。術(shù)后60 d，RH負(fù)重恢復(fù)到最高水平，但與LH比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)RH負(fù)重均低于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 后肢觸地面積結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH觸地面積基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后RH 觸地面積明顯減小，LH觸地面積有所增加。術(shù)后45、60 d，RH觸地面積恢復(fù)到最高水平，但與LH比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)RH 觸地面積均小于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖4 術(shù)前應(yīng)用Tekscan walkway步態(tài)分析儀采集步態(tài)原始圖

2.4 后肢觸地沖量結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH觸地沖量大小基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后RH觸地沖量明顯減小，LH觸地沖量有所增加。術(shù)后60 d，RH觸地沖量恢復(fù)到最高水平，但與LH比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)RH觸地沖量均小于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.5 后肢足底局部最大壓力結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH足底局部最大壓力基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7、15、30、45 d RH足底局部最大壓力明顯降低，LH足底局部最大壓力有所升高，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后60 d，RH足底局部最大壓力恢復(fù)到最高水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在術(shù)后75、90 d，RH足底局部最大壓力均低于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

2.6 后肢擺動(dòng)相時(shí)間結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH擺動(dòng)相時(shí)間基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7、15、30 d RH 擺動(dòng)相時(shí)間明顯延長(zhǎng)，LH擺動(dòng)相時(shí)間基本保持不變，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后45、60 d RH擺動(dòng)相時(shí)間逐漸恢復(fù)到自然狀態(tài)水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在術(shù)后75、90 d，RH擺動(dòng)相時(shí)間均長(zhǎng)于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

2.7 后肢支撐相時(shí)間結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH支撐相時(shí)間基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7、15、30、45 d RH支撐相時(shí)間明顯縮短，LH支撐相時(shí)間有所增加，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后60、75 d RH支撐相時(shí)間逐漸恢復(fù)到自然狀態(tài)水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在術(shù)后90d，RH支撐相時(shí)間短于LH，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表6）。

2.8 病理觀察結(jié)果

番紅“O”染色顯示，LH軟骨表面完整，蛋白多糖含量豐富，軟骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)正常，纖維化不明顯。相反，RH軟骨表面破壞明顯，裂痕較深，蛋白多糖含量明顯下降，軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多、形態(tài)各異，纖維化明顯（圖5）。

3 討論

OA是一種病因復(fù)雜、病理變化緩慢，多種生物力學(xué)和生物化學(xué)因素綜合作用導(dǎo)致的一種關(guān)節(jié)軟骨慢性退變性疾病,具體發(fā)病機(jī)制仍不明確[13]。目前研究較為明確的是炎癥因素在OA發(fā)病過程中較為關(guān)鍵，退變關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)大量炎癥因子、基質(zhì)降解酶類，促使大量關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞異常凋亡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)一步退變[14]。在脛股OA動(dòng)物模型制備方法中，ACLT較為常見。但ACLT 模型在模擬炎癥作用的同時(shí)破壞前交叉韌帶，破壞膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，改變膝關(guān)節(jié)的正常力學(xué)性能，不利于脛股OA獨(dú)立病因的分析。所以本實(shí)驗(yàn)采用ACLR模型，單一因素模擬脛股OA[15]。髕股關(guān)節(jié)為膝關(guān)節(jié)的重要組成部分，在臨床OA患者中其病變較常見，也較嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)采用髕骨脫位術(shù)制備髕股關(guān)節(jié)炎模型。本實(shí)驗(yàn)采用ACLR 聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備多間室OA模型，其病變特征更符合臨床。

表1 術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH負(fù)重比較[n=6，M（QR），%BW]

表2 術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH觸地面積比較[n=6，M（QR），cm2]

表3 術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH觸地沖量比較[n=6，M（QR），%BW·s]

表4 術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH足底局部最大壓力比較[n=6，M（QR），%BW]

表5 術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH擺動(dòng)相時(shí)間比較[n=6，M（QR），s]

表6 術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RH與LH支撐相時(shí)間比較[n=6，M（QR），s]

圖5 LH和RH病理觀察結(jié)果番紅“O”染色圖

步態(tài)是指人或動(dòng)物通過肢體運(yùn)動(dòng)并向前移動(dòng)的一種周期性的形式和狀態(tài)特征。機(jī)體站立或步行時(shí)足底與支撐面之間的相互作用力能反映下肢及全身的生理、解剖及功能等方面的變化。步態(tài)分析即通過生物力學(xué)和運(yùn)動(dòng)學(xué)手段，揭示步態(tài)異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和影響因素，幫助早期臨床診斷，療效評(píng)估，指導(dǎo)康復(fù)[16,17]。目前Tekscan walkway系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛[18]。

本實(shí)驗(yàn)采用巴馬小型豬，四肢承重，十字交叉邁步，自然健康狀態(tài)下，LH與RH負(fù)重基本相當(dāng)。由于手術(shù)創(chuàng)傷、疼痛，導(dǎo)致術(shù)后RH疼痛不能負(fù)重，尤其術(shù)后7 d。隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，RH負(fù)重不斷恢復(fù)，在術(shù)后60 d達(dá)到最高水平，但仍未恢復(fù)到正常，此時(shí)手術(shù)疼痛已經(jīng)不是主要原因，可能主要由于髕骨脫位，RH膝關(guān)節(jié)的正常屈伸、行走功能受到影響，導(dǎo)致RH負(fù)重仍恢復(fù)不到正常水平。而術(shù)后75、90 d RH的負(fù)重水平又明顯下降，其原因可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨病變，且較為嚴(yán)重。已有小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后1周甚至第二天，膝關(guān)節(jié)周圍炎癥因子水平開始顯著上升，已經(jīng)觸發(fā)軟骨降解、退變[19,20]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RH膝關(guān)節(jié)受到創(chuàng)傷負(fù)重下降時(shí)，LH反而負(fù)重增加，起到代償作用，這一現(xiàn)象與臨床一致。一側(cè)肢體發(fā)生OA病變時(shí)，身體中心就不斷轉(zhuǎn)向?qū)?cè)肢體。觸地面積為機(jī)體行走時(shí)足底與支撐面的接觸面積，其變化趨勢(shì)類似于后肢負(fù)重變化趨勢(shì)，原因較為一致。術(shù)后7 d RH觸地面積最小，可能由于疼痛導(dǎo)致RH腳尖點(diǎn)地前行，術(shù)后60 d恢復(fù)到最大接觸面積。術(shù)后75、90 d可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨病變，觸地面積又出現(xiàn)下降趨勢(shì)。觸地沖量為足底踩踏地面過程中作用力的時(shí)間累積，是支持力與時(shí)間的乘積，影響因素為負(fù)重大小、支撐時(shí)間。其變化趨勢(shì)是負(fù)重趨勢(shì)和支撐相趨勢(shì)綜合作用的結(jié)果，其差異更加顯著。由于足底骨性構(gòu)造、足弓的存在，足底與支撐面接觸時(shí)受力并不均勻，人類足底外側(cè)受力明顯高于內(nèi)側(cè)[21]，四足動(dòng)物足底受力類似人類，并不均勻。本研究得出術(shù)后早期RH足底最大壓力變化趨勢(shì)與負(fù)重變化趨勢(shì)較為一致，術(shù)后60 d恢復(fù)到較高水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后75、90 d可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨病變，RH足底局部最大壓力又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，低于LH且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為四肢負(fù)重，十字交叉邁步，但其特征類似于人類，整個(gè)步態(tài)周期由支撐相和擺動(dòng)相組成。由于手術(shù)的創(chuàng)傷、疼痛，導(dǎo)致術(shù)后RH支撐相顯著縮短，擺動(dòng)相延長(zhǎng)，尤其在術(shù)后7、15 d。其表現(xiàn)類似于臨床OA患者，病變肢體邁步緩慢，撐地時(shí)間縮短。擺動(dòng)相期間肢體處于非負(fù)重狀態(tài)，其恢復(fù)較快，術(shù)后45 d恢復(fù)到自然狀態(tài)水平。術(shù)后75、90 d又出現(xiàn)惡化趨勢(shì)。LH在擺動(dòng)相期間處于非負(fù)重狀態(tài)，不起代償作用，故LH的擺動(dòng)相在術(shù)前、術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)變化不明顯。支撐相期間，肢體處于負(fù)重狀態(tài)，其恢復(fù)相對(duì)較慢，術(shù)后60 d RH恢復(fù)到自然狀態(tài)水平。術(shù)后90 d又出現(xiàn)惡化趨勢(shì)。

番紅“O”染色結(jié)果顯示，RH有明顯的軟骨退變，其原因可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)所有間室軟骨病變，且較為嚴(yán)重；此外，髕骨處于脫位狀態(tài)，膝關(guān)節(jié)失去正常的力學(xué)性能。生物力學(xué)和生物化學(xué)因素綜合作用導(dǎo)致RH病變嚴(yán)重。LH單純起負(fù)重代償作用，其影響較小，軟骨退變不明顯。

本實(shí)驗(yàn)不足之處：OA 是一種慢性軟骨退變性疾病，其病程較長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)術(shù)后90 d 安樂處死所有動(dòng)物，不利于了解OA的全部病理過程。

本實(shí)驗(yàn)采用ACLR聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備大動(dòng)物多間室OA模型，較為客觀、全面，同時(shí)采集、分析步態(tài)實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)和數(shù)據(jù)。初步確定多間室OA模型制備成功；初步明確多間室OA步態(tài)行為學(xué)變化，為今后動(dòng)物模型制備、疾病機(jī)制基礎(chǔ)研究、臨床疾病治療及康復(fù)提供一定幫助。