（司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

芬太尼（fentanyl）是一種短效、合成阿片類(lèi)藥物，于1960年由比利時(shí)科學(xué)家Paul Janssen首次合成，其鎮(zhèn)痛效果約為嗎啡的100倍[1-4]。隨后，Paul Janssen在對(duì)芬太尼結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系進(jìn)行研究后，開(kāi)發(fā)了一系列芬太尼類(lèi)似物。由于芬太尼及其類(lèi)似物鎮(zhèn)痛效果好，且容易獲得，開(kāi)發(fā)不久后就發(fā)生了濫用情況，甚至作為毒品使用。芬太尼類(lèi)物質(zhì)通常被摻雜在海洛因等毒品中混合使用，但由于芬太尼類(lèi)物質(zhì)存在呼吸抑制等不良反應(yīng)，大大增加了致死風(fēng)險(xiǎn)[5-8]。近幾年，芬太尼類(lèi)物質(zhì)的更新速度很快，各種新型芬太尼類(lèi)物質(zhì)不斷出現(xiàn)。在20世紀(jì)80年代，α-甲基芬太尼和3-甲基芬太尼出現(xiàn)在毒品市場(chǎng)上，此時(shí)還出現(xiàn)了一些其他芬太尼類(lèi)似物，如對(duì)-氟芬太尼、β-羥基芬太尼以及麻醉效果極強(qiáng)的卡芬太尼。芬太尼的衍生物3-甲基芬太尼的作用和毒性較海洛因強(qiáng)1000倍，幾毫克即可致命[9]。而卡芬太尼的效能約為嗎啡的10000倍，是目前世界上最強(qiáng)效的阿片類(lèi)藥物，規(guī)定只能用于大型動(dòng)物麻醉和制動(dòng)[6]。2010年后，芬太尼類(lèi)物質(zhì)濫用出現(xiàn)新的高峰，乙酰芬太尼、丁?；姨?、β-羥基硫代芬太尼和呋喃芬太尼等多種芬太尼類(lèi)似物均出現(xiàn)濫用情況[9]。2017年，甲氧乙酰芬太尼和環(huán)丙基芬太尼也在案例中被檢出[10-12]。

芬太尼類(lèi)物質(zhì)濫用情況嚴(yán)重且致死率高，這對(duì)各國(guó)公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012—2014年美國(guó)約7100例與海洛因相關(guān)的死亡案例中，有41%涉及芬太尼[13]。2015年，美國(guó)疾病控制中心（Centers for Disease Control，CDC）報(bào)道了近10000例與芬太尼類(lèi)似物相關(guān)的死亡案例，比2014年增加了72%[14]。在我國(guó)，芬太尼類(lèi)物質(zhì)的生產(chǎn)和走私也呈上升趨勢(shì)，2016年發(fā)現(xiàn)的芬太尼類(lèi)物質(zhì)有66份，但在2012—2015年總計(jì)僅發(fā)現(xiàn)6份[15]。隨著全球范圍特別是北美地區(qū)芬太尼及其衍生物濫用導(dǎo)致死亡人數(shù)的急劇增加，對(duì)于芬太尼類(lèi)新精神活性物質(zhì)濫用的鑒定和打擊預(yù)防是當(dāng)前司法鑒定領(lǐng)域的重要任務(wù)。目前，我國(guó)列管的芬太尼類(lèi)物質(zhì)已有25種，超過(guò)聯(lián)合國(guó)列管的21種。在2018年12月1日中美元首會(huì)晤后，兩國(guó)就禁毒合作達(dá)成共識(shí)。中方?jīng)Q定對(duì)芬太尼類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行整類(lèi)列管，將芬太尼類(lèi)物質(zhì)指定為一種受控物質(zhì)。

近年來(lái)，已有文獻(xiàn)報(bào)道在全血[11，16]、尿樣[17]、毛發(fā)[18-22]、唾液[23-25]以及干血點(diǎn)[26-27]等生物基質(zhì)中對(duì)芬太尼類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析，分析方法主要為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[28-29]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法[30]。但這些方法中多數(shù)僅能分析幾種芬太尼類(lèi)物質(zhì)，用血量大且耗時(shí)長(zhǎng)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物的分離分析。因此，本研究擬采用UPLC-MS/MS法對(duì)全血中20種芬太尼類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，旨在建立簡(jiǎn)單、快速、靈敏的芬太尼類(lèi)物質(zhì)篩選方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際案例。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QTRAP?6500三重四極桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX公司），ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），SB-2200-T超聲波清洗儀（美國(guó)Branson公司），BSA124S電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，MD200-2氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），TDZ4-WS離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司），MiniSpin高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

芬太尼（fentanyl）、阿芬太尼（alfentanil）、去丙?；姨幔跱-phenyl-1-（2-phenylethyl）-4-piperidinamine，4-ANPP］、丙烯酰芬太尼（acrylfentanyl）、丁酰芬太尼（butyrylfentanyl）、異丁酰芬太尼（isobutyryl fentanyl）、3-甲基芬太尼（3-methylfentanyl）、對(duì)-氟芬太尼（parafluorofentanyl）、β-羥基硫代芬太尼（β-hydroxythiofentanyl）、戊酰芬太尼（valerylfentanyl）、對(duì)-氟丁酰芬太尼［para-fluorobutyryl fentanyl（PFBF）］、4-氟異丁酰芬太尼（4-fluoroisobutyrlfentanyl）、奧芬太尼（ocfentanil）、呋喃芬太尼（furanylfentanyl）、瑞芬太尼（remifentanil）、舒芬太尼（sufentanil）、卡芬太尼（carfentanil）、乙酰芬太尼（acetylfentanyl）、甲氧乙酰芬太尼（methyoxyacetyl fentanyl）、環(huán)丙基芬太尼（cyclopropylfentanyl）、芬太尼-D5（fentanyl-D5，作為內(nèi)標(biāo)）均購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司。其中芬太尼及阿芬太尼對(duì)照品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，其他對(duì)照品質(zhì)量濃度均為100 μg/mL。甲醇、乙腈購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，乙酸銨（色譜純）、98%甲酸（優(yōu)級(jí)純）購(gòu)自瑞士Fluka公司，其他試劑均為分析純，去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

硼砂緩沖溶液：取硼砂適量，置于250mL容量瓶中，加去離子水至刻度，配制pH=9.2的緩沖溶液。

1.2 溶液配制

取各化合物對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為2 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為1000、200、100、10、1ng/mL的工作液。

取芬太尼-D5適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的對(duì)照品溶液，再用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100ng/mL的工作液。

1.3 樣品處理

取抗凝全血樣品100 μL置于2 mL離心管中，精確加入100ng/mL的芬太尼-D510μL，混合10s，加入硼砂緩沖溶液（pH=9.2）100μL、乙酸乙酯0.7mL，渦旋30 s，以9 700×g離心5 min。取上層有機(jī)相置于5 mL離心管中，40℃下吹干。加入流動(dòng)相A 200 μL復(fù)溶，以1249×g離心5min，取上清液100μL裝入進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)襯管中供UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源采用正離子模式（ESI+），離子噴射電壓5 500 V，碰撞氣7 psi，氣簾氣30 psi，霧化氣40psi，輔助氣40psi，離子源溫度為500℃。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，各化合物參數(shù)見(jiàn)表1，選用兩對(duì)母離子/子離子進(jìn)行定性分析，其中響應(yīng)較高的第一對(duì)離子為定量離子對(duì)。

表1 20種芬太尼類(lèi)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間

1.4.2 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1mm，1.8μm，美國(guó)Waters公司），柱溫為室溫；流動(dòng)相A為20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），流動(dòng)相B為乙腈；流速為0.3mL/min。采用梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2。進(jìn)樣量為5μL。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

采用行業(yè)公認(rèn)的方法有效性驗(yàn)證體系[31]，包括選擇性、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)參考MATUSZEWSKI等[32]提出的方法。

表2 梯度洗脫程序 （%）

1.5.1 選擇性

分別對(duì)10個(gè)不同來(lái)源的空白全血樣品按已建立的方法進(jìn)行分析，考察全血中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)20種目標(biāo)物是否有干擾。

1.5.2 LOD、LOQ和線性

取空白血1.0mL，加入20種目標(biāo)物的混合對(duì)照品工作液，配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00ng/mL的全血樣品。取全血樣品100μL，按1.3節(jié)方法處理、分析。以每個(gè)目標(biāo)物全血質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），目標(biāo)物與芬太尼-D5的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)（權(quán)重系數(shù)為1/x）最小二乘法進(jìn)行回歸，求得線性方程。以信噪比（S/N）大于3的質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OD，以信噪比（S/N）大于10、精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于20%且準(zhǔn)確度在80%～120%的質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OQ。

1.5.3 準(zhǔn)確度和精密度

取空白血1.0mL，加入20種目標(biāo)物的混合對(duì)照品工作液，配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.5、5.0、30.0ng/mL的全血樣品。取全血樣品100μL，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)6份樣品，按所建立的方法進(jìn)行處理、進(jìn)樣，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。連續(xù)進(jìn)樣4d，計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度。

1.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

選取低（芬太尼為0.5ng/mL，其他為0.2ng/mL）、中（5.0 ng/mL）、高（30.0 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的全血樣品，按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣的峰面積設(shè)為A，空白樣品按1.3節(jié)方法處理后，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣后的峰面積設(shè)為B，對(duì)照品溶液吹干復(fù)溶后進(jìn)樣的峰面積設(shè)為C，提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SD大鼠4只，雌雄各2只，體質(zhì)量190～230 g，自尾靜脈注射舒芬太尼，給藥劑量為10μg/kg。于給藥后2、5、10、15、30、45、60min以及1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、10.0、12.0、16.0、24.0 h眼眶取血約0.3 mL。取血液0.1mL按照1.3節(jié)進(jìn)行前處理，取100μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

本研究比較了不同樣品前處理方法（蛋白沉淀和液液萃?。┑幕厥章?。在0.1 mL空白全血中添加20種目標(biāo)物的混合對(duì)照品工作液，配置成質(zhì)量濃度為5 ng/mL的全血樣品，分別用蛋白沉淀和液液萃取法進(jìn)行前處理。蛋白沉淀法為0.1 mL全血加入0.9 mL乙腈，取上清液吹干后用0.1 mL流動(dòng)相A復(fù)溶后進(jìn)樣；液液萃取法分別考察了乙醚和乙酸乙酯兩種提取溶劑，取0.1mL全血，加入0.1mL硼砂緩沖溶液（pH=9.2），再加入0.7 mL乙醚或乙酸乙酯進(jìn)行提取，提取液吹干后用0.1mL流動(dòng)相A復(fù)溶后進(jìn)樣。

全血經(jīng)乙腈沉淀蛋白后提取回收率為47.76%～63.64%，經(jīng)乙醚液液萃取后提取回收率為54.33%～57.21%，而經(jīng)乙酸乙酯液液萃取后提取回收率均大于80%。結(jié)果表明，用乙酸乙酯液液萃取的提取效率較高。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙酸乙酯作為液液萃取的提取溶劑。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 選擇性

10份空白全血樣品經(jīng)處理后，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)物測(cè)定。

2.2.2 LOD、LOQ和線性

各目標(biāo)物L(fēng)OD、LOQ和線性結(jié)果如表3。各目標(biāo)物在質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OQ時(shí)的色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，全血樣品中20種目標(biāo)物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.99。20種目標(biāo)物的LOD為0.01～0.03ng/mL，LOQ為0.05～0.20ng/mL，可以滿(mǎn)足工作實(shí)踐中的檢測(cè)需要。

表3 20種目標(biāo)物L(fēng)OD、LOQ和線性范圍

續(xù)表3

圖1 各目標(biāo)物在質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OQ時(shí)的色譜圖（內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10ng/mL）

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

各目標(biāo)物的精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表4。本方法日內(nèi)精密度和日間精密度分別為3.02%～11.92%、4.50%～14.24%，均在±15%之內(nèi)；準(zhǔn)確度為87.69%～114.68%，均在85%～115%。上述結(jié)果表明該方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

2.2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

本方法的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，各目標(biāo)物經(jīng)本方法提取后，提取回收率為85.35%～101.80%，表明經(jīng)乙酸乙酯提取后可達(dá)到比較滿(mǎn)意的提取效率。基質(zhì)效應(yīng)為79.96%～111.40%，說(shuō)明本方法無(wú)明顯基質(zhì)影響。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用所建方法檢測(cè)注射舒芬太尼后SD大鼠血液中的舒芬太尼。結(jié)果顯示，在注射舒芬太尼后2min，大鼠血液中即可檢測(cè)出舒芬太尼，平均血藥質(zhì)量濃度為1.26ng/mL，說(shuō)明所建方法適用于實(shí)際樣品中舒芬太尼的檢測(cè)分析。大鼠血液中舒芬太尼質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)在注射后5～10 min，平均血藥質(zhì)量濃度為1.72ng/mL。注射后10h在大鼠血液中仍能檢測(cè)出舒芬太尼，12h之后大鼠血液中舒芬太尼質(zhì)量濃度低于LOD。舒芬太尼注射后起效快，持續(xù)時(shí)間較芬太尼長(zhǎng)，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道相符。大鼠靜脈注射舒芬太尼（10μg/kg）后全血中舒芬太尼的濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

表4 各目標(biāo)物的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng) （%）

續(xù)表4

圖2 大鼠靜脈注射舒芬太尼（10μg/kg）后全血中舒芬太尼的濃度-時(shí)間曲線

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定全血中20種芬太尼類(lèi)似物，在8min內(nèi)完成了對(duì)各化合物的分析測(cè)定。該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好，適用于實(shí)際樣品的檢測(cè)分析。運(yùn)用所建方法檢測(cè)注射舒芬太尼后SD大鼠血液中的舒芬太尼，注射后10h在大鼠血液中仍能檢測(cè)出舒芬太尼。