李玨丹 崔敏

[摘要]目的：觀察氟化物對(duì)小鼠成釉細(xì)胞樣細(xì)胞（LS8細(xì)胞）增殖、氧化應(yīng)激以及凋亡的影響。方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LS8細(xì)胞，在培養(yǎng)液中分別加入終濃度為0、0.5、1、2、4和8mM的氟化鈉（NaF）溶液，培養(yǎng)24h和48h后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);生化方法檢測(cè)細(xì)胞丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性;qRT-PCR檢測(cè)過(guò)氧化氫酶（Cat）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1（Gpx-1）和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Gst）mRNA水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;Western blotting檢測(cè)caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)改變。結(jié)果：過(guò)量氟抑制LS8細(xì)胞增殖，且隨著NaF濃度增加，細(xì)胞增殖呈下降趨勢(shì);過(guò)量氟顯著增加LS8細(xì)胞內(nèi)MDA含量，降低SOD活性及Gpx-1、Gst mRNA表達(dá)水平;過(guò)量氟引起LS8細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞凋亡，且伴隨著caspase-9，caspase-3表達(dá)的顯著增加。結(jié)論：過(guò)量氟抑制LS8細(xì)胞增殖，擾亂細(xì)胞的氧化與抗氧化平衡并誘發(fā)氧化應(yīng)激，持續(xù)的氧化應(yīng)激最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]氟化物;LS8細(xì)胞;增殖;氧化應(yīng)激;凋亡

[中圖分類號(hào)]R329.2+8? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）09-0089-04

牙釉質(zhì)發(fā)育期，機(jī)體長(zhǎng)期攝入過(guò)量氟可導(dǎo)致氟牙癥發(fā)生，引起牙釉質(zhì)白堊色條紋或斑塊，重者伴釉質(zhì)缺損，嚴(yán)重影響患者的咀嚼功能和顏面美觀[1-2]。然而氟牙癥缺乏有效治療手段，因而探究氟牙癥發(fā)病機(jī)制，對(duì)于有效控制氟牙癥發(fā)生具有重要現(xiàn)實(shí)意義。釉原蛋白在釉質(zhì)形成后期未得到充分降解而滯留于釉基質(zhì)中，影響釉質(zhì)礦化，導(dǎo)致氟牙癥發(fā)生[3-4]。釉原蛋白滯留的機(jī)制主要包括過(guò)量氟對(duì)釉基質(zhì)蛋白、釉基質(zhì)蛋白酶及成釉細(xì)胞的影響等，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為過(guò)量氟可下調(diào)成熟成釉細(xì)胞中釉基質(zhì)蛋白酶KLK4表達(dá)[3，5-6]，對(duì)釉基質(zhì)蛋白酶MMP20及釉基質(zhì)蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響[3，5，7-8]。目前過(guò)量氟對(duì)成釉細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和凋亡的影響報(bào)道較少且尚未完全闡明。本研究用不同濃度氟化鈉（sodium fluoride，NaF）作用于體外培養(yǎng)的小鼠成釉細(xì)胞樣細(xì)胞（LS8細(xì)胞），觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和凋亡的影響，為研究氟牙癥的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑：LS8細(xì)胞由美國(guó)南加州大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Malcolm L. Snead教授饋贈(zèng)，高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)），Annexin V-PE/7-AAD（BD Biosciences，美國(guó)），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Marker（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），SYBR?Premix Ex TagTM試劑盒（TaKaRa，日本），RIPA裂解液（Beyotime，中國(guó)），caspase-9、caspase-3抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：Thermo Forma二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀（Tecan，奧地利），實(shí)時(shí)定量PCR儀（Agilent Technologies，美國(guó)），微量核酸蛋白定量?jī)xNano Drop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），凝膠成像分析系統(tǒng)（Gene有限公司，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 LS8細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：用10% FBS、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)LS8細(xì)胞，隔天換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)：用終濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0mM的NaF溶液孵育96孔板中的LS8細(xì)胞（100μl/孔），每組3個(gè)復(fù)孔。24h和48h后，每孔加入10μl CCK-8溶液繼續(xù)孵育4h。酶聯(lián)儀測(cè)定各孔的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：終濃度為0、1、2mM的NaF溶液孵育LS8細(xì)胞48h后消化，800rpm離心5min，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次。加入1×Binding Buffer重懸并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1×106/ml，取100μl懸液于流式管內(nèi)，加入PE Annexin V和7-AAD各5μl混勻后避光、室溫15min后，加入400μl 1×Binding Buffer混勻，樣品于1h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測(cè)：用終濃度為0、1、2mM的NaF溶液孵育6孔板中的LS8細(xì)胞，24h后每孔加入100μl細(xì)胞裂解液，1min后每孔再加入300μl PBS把貼壁細(xì)胞充分吹打下來(lái)，操作過(guò)程均在冰浴上進(jìn)行。制備好的細(xì)胞勻漿用于MDA和SOD的測(cè)定。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：終濃度為0、1、2mM的NaF溶液孵育LS8細(xì)胞24h后Trizol試劑提取總RNA，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度和純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明對(duì)2μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR反應(yīng)體系：5μl SYBR Green PCR反應(yīng)液、0.4μl cDNA模板、1μl PCR引物，加雙蒸水至10μl。β-Actin為內(nèi)參對(duì)照，采用2-ΔΔCT法對(duì)樣本進(jìn)行相對(duì)定量。引物序列見(jiàn)表1。

1.3.6 Western blotting：用終濃度為0、1、2mM NaF培養(yǎng)液培養(yǎng)LS8細(xì)胞48h后加入RIPA裂解液，冰上裂解后離心收集上清。BCA法測(cè)蛋白濃度，取細(xì)胞總蛋白25μg，5μl Marker，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳。在200mA恒流條件下，轉(zhuǎn)膜1.5h至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉PVDF膜2h。后分別加入抗兔caspase-9、caspase-3、β-Actin抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后用山羊抗兔IgG（H+L）二抗室溫孵育1.5h。用TBST洗膜后，將PVDF膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)盒中，ECL發(fā)光液均勻放置于PVDF膜上，調(diào)整參數(shù)曝光后用圖像分析儀處理。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)用（x?±s）表示，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用Student t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 氟化物對(duì)LS8細(xì)胞增殖活力的影響：染氟24h和48h，隨著NaF濃度增加，LS8細(xì)胞增殖活力逐漸下降，LS8細(xì)胞的存活率呈下降趨勢(shì)（與0mM比較，P<0.05）。見(jiàn)表2，圖1。

2.2 氟化物對(duì)LS8細(xì)胞形態(tài)的影響：對(duì)照組LS8細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞輪廓清晰，呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，多為長(zhǎng)梭形或多角形。與對(duì)照組相比，1mM NaF組細(xì)胞胞體呈現(xiàn)不同程度的皺縮，出現(xiàn)少量細(xì)胞凋亡。2mM NaF組細(xì)胞胞體明顯收縮、變小，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞數(shù)量明顯下降，間隙增大，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多。見(jiàn)圖2。

2.3 氟化物對(duì)LS8細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響：NaF作用LS8細(xì)胞24h后，MDA含量顯著增加（與0mM比較，P<0.05），SOD活性和Gpx-1，Gst mRNA表達(dá)均明顯降低（與0mM比較，P<0.05），然而Cat mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變。見(jiàn)圖3。

2.4 氟化物對(duì)LS8細(xì)胞凋亡的影響：Annexin V-PE/7-AAD雙染法結(jié)果顯示：NaF作用LS8細(xì)胞48h后，隨著NaF濃度增加，LS8細(xì)胞凋亡率逐漸增高（與0mM比較，P<0.05）（圖4A）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：1mM NaF作用LS8細(xì)胞48h后，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)輕微增加，2mM NaF作用LS8細(xì)胞48h后，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增加（與0mM比較，P<0.05）（圖4B～D）。

3? 討論

成釉細(xì)胞是釉質(zhì)形成的關(guān)鍵細(xì)胞[9]。LS8細(xì)胞系是分離自小鼠第一磨牙成釉器上皮并被永生化的細(xì)胞系，用于釉質(zhì)發(fā)育和氟牙癥發(fā)病機(jī)制的研究[10-11]。本研究中筆者通過(guò)建立體外染氟LS8細(xì)胞模型，來(lái)觀察氟化物對(duì)細(xì)胞增殖，氧化應(yīng)激和凋亡的影響。

氟化物可影響成釉細(xì)胞增殖活性，但對(duì)其具體作用尚具有爭(zhēng)議。馬林、王琳等[12-14]分別將0、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4mM NaF作用于原代培養(yǎng)大鼠成釉細(xì)胞和大鼠類成釉細(xì)胞系HAT-7 24、48和72h后，發(fā)現(xiàn)0.4和0.8mM NaF促進(jìn)細(xì)胞增殖，1.6、3.2和6.4mM NaF則抑制細(xì)胞增殖，認(rèn)為氟化物對(duì)成釉細(xì)胞增殖具有雙重作用。然而Yang，Zhao等[15-16]將0、0.5、1、1.5、2mM NaF作用于小鼠成釉細(xì)胞樣細(xì)胞系LS8 24、48和72h時(shí)，發(fā)現(xiàn)NaF降低LS8細(xì)胞增殖活性。本研究中筆者將0、0.5、1、1.5、2、4、8mM NaF作用于LS8細(xì)胞24、48h后發(fā)現(xiàn)NaF降低LS8細(xì)胞增殖活性，呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，與Yang、Zhao等結(jié)果一致。推測(cè)與馬林、王琳等研究結(jié)果略有不同的可能原因?yàn)檫x用的細(xì)胞系和體外實(shí)驗(yàn)條件不同，導(dǎo)致不同細(xì)胞系對(duì)氟化物耐受力也不完全相同。研究還顯示4mM、8mM NaF處理LS8細(xì)胞24h和48h后，細(xì)胞存活率明顯低于50%，因此選用1mM、2mM NaF濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

過(guò)量氟攝入可干擾氧代謝引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，同時(shí)消耗抗氧化物和自由基清除酶類，導(dǎo)致氧化與抗氧化失調(diào)進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激，對(duì)機(jī)體造成損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量和抗氧化酶SOD、Gpx，Gst和Cat的活性常被用作評(píng)估氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[17-18]。本研究顯示過(guò)量氟使LS8細(xì)胞中MDA含量增加，SOD活性及Gpx-1，Gst mRNA水平降低，提示過(guò)量氟可促進(jìn)LS8細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，降低抗氧化酶活性，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果還顯示過(guò)量氟對(duì)Cat無(wú)明顯影響，推測(cè)可能原因?yàn)楦骺寡趸笇?duì)氟敏感程度不一，也可能與復(fù)雜的氧化與抗氧化系統(tǒng)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡通路主要包括caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑、caspase-8介導(dǎo)的死亡受體途徑及caspase-12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[19]。上述途徑最后均通過(guò)激活下游caspase-3，引發(fā)細(xì)胞形態(tài)改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。本文采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)示1mM和2mM NaF作用LS8細(xì)胞48h后引起細(xì)胞顯著凋亡。利用Western blotting發(fā)現(xiàn)1mM NaF作用48h時(shí)細(xì)胞中caspase-9和caspase-3活化蛋白輕微增加，而2mM NaF作用時(shí)細(xì)胞中caspase-9和caspase-3活化蛋白顯著增加，提示過(guò)量氟誘導(dǎo)的LS8細(xì)胞凋亡很可能與線粒體凋亡途徑激活有關(guān)。值得注意的是，1mM NaF作用LS8細(xì)胞48h后，Annexin V-PE/7-AAD雙染法顯示細(xì)胞凋亡顯著增加，但Western blotting示caspase-9和caspase-3蛋白輕微活化，推測(cè)可能與Western blotting檢測(cè)不如Annexin V-PE/7-AAD雙染法敏感有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探究了過(guò)量氟對(duì)細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)量氟抑制LS8細(xì)胞增殖，擾亂細(xì)胞氧化與抗氧化平衡并誘發(fā)氧化應(yīng)激，持續(xù)的氧化應(yīng)激最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而凋亡很可能與線粒體途徑激活有關(guān)，其具體機(jī)制待深入探究。

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[收稿日期]2019-02-25

本文引用格式：李玨丹，崔敏，許瑩，等.氟對(duì)體外培養(yǎng)LS8細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激與凋亡的作用研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（9）：89-92.