正交設(shè)計(jì)優(yōu)選黃芪總黃酮提取工藝

梁泰帥　趙肖瓊　馮美

【摘要】目的：探究黃芪總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。方法：基于單因素試驗(yàn)，以黃芪總黃酮提取率為評價(jià)指標(biāo)，通過L9（34）正交試驗(yàn)法對影響黃芪總黃酮提取率的4個(gè)因素（乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間）進(jìn)行考察，優(yōu)選黃芪總黃酮提取工藝參數(shù)。結(jié)果：黃芪總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度90%、水浴溫度80?℃、料液比1∶12和提取時(shí)間2?h，在此條件下，黃芪總黃酮提取率為0.286%。結(jié)論：該提取工藝表現(xiàn)出操作簡單、重復(fù)性穩(wěn)定的特點(diǎn)，以期為黃芪資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】黃芪;總黃酮;正交試驗(yàn);提取工藝

【中圖分類號】R285【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）9-0030-04

Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Radix Astragali by Orthogonal Design

LIANG Taishuai1ZHAO Xiaoqiong2FENG Mei1

1.College of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2. Department of Environmental and Safety Engineering， Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan 030008， China

Abstract：Objective Study on the optimal process parameters for extracting total flavonoids from radix Astragalus. Methods Based on the single factor test， with extraction rate of total flavonoids as indicators and ethanol concentration， water bath temperature， solid-liquid ratio，extraction time as investigated factors， orthogonal array design L9（34） experiments were projected to optimize the extraction process of total flavonoids from radix Astragalus. Results The results showed that the extraction rate of total flavonoids from radix Astragalustragalus was 0.286% with the optimal parameters that the solid-fulid ratio， ethanol concentration， water bath temperature and extracting time were 1∶12?g/mL， 90%， 80?℃ and 2h. Conclusion The extraction process is feasible and stable which provide a scientific basis for the rational development and utilization of astragalus resources.

Key：words：Radix Astragali;Total Flavonoids; OrthogonalTest; Extraction Process

黃芪是山西的一種重要道地藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、性溫，具有補(bǔ)氣固表、排膿降壓、提高機(jī)體免疫力等功效，素有“十藥八芪”之稱[1]。黃酮類化合物是黃芪發(fā)揮功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和有效部位，可作為抗氧化劑在清除活性氧自由基、抗菌消炎、延緩衰老、抗過敏等方面有著顯著的藥理活性，并已在臨床防治老年高血壓、冠心病和視網(wǎng)膜出血等疾病方面有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。因此，優(yōu)化黃芪總黃酮的提取工藝對其藥理學(xué)作用的深入探究意義重大。本研究分別對乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定四因素三水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，考察黃芪總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，以期為黃芪資源的合理開發(fā)以及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試藥蒙古黃芪藥材飲片（山西渾源萬生黃芪開發(fā)有限公司）;蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610）;95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為分析純。

1.2儀器電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;中藥材粉碎機(jī)（FW177，天津市泰斯特儀器有限公司）;萬分之一天平（BSA224S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，國華電器有限公司）;循環(huán)水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海予申儀器有限公司];紫外可見分光光度計(jì)（UV-1200，上海美譜達(dá)儀器有限公司）;低速大容量多管離心機(jī)（LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3方法

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照張浩等[3]的方法，稍作改進(jìn)：準(zhǔn)確稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品25?mg于100?mL容量瓶中，加70%乙醇定容，得到質(zhì)量濃度為0.25?mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0?mL于7只10?mL容量瓶中，然后分別添加3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0?mL的蒸餾水;再向各瓶內(nèi)添加5%的NaNO2溶液 0.3?mL，混勻并靜置6?min;繼續(xù)添加10%的Al（NO3）2溶液 0.3?mL，混勻并靜置6?min;再添加4%的NaOH溶液4?mL，最后用70%的乙醇定容至10?mL，混勻并靜置12?min，依次在510?nm處測定各瓶內(nèi)反應(yīng)液的吸光值，以吸光值Y和蘆丁質(zhì)量濃度X分別作為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=0.6804X-0.0012，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

1.3.2精密度試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.5?mL于10?mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光值，重復(fù)測定6次，計(jì)算出RSD為0.481%，表明精密度良好。

1.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品溶液制備[4]：將黃芪藥材于60℃烘干至恒重，粉碎后過50目篩。精確稱取黃芪粉末5?g于圓底燒瓶中，加入10倍量90%乙醇，70?℃水浴下回流提取2次，每次2?h，趁熱減壓抽濾2次，合并濾液，5000?r/min離心5?min，上清液即為供試品溶液。

準(zhǔn)確吸取供試品溶液1.5?mL于10?mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法分別于0、15、30、45、60、90、120?min測定吸光值，計(jì)算出RSD為1.176%，表明供試品溶液在2?h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)精確稱取黃芪粉末共6份，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，各取1.5?mL于10?mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光值，計(jì)算出RSD為0.912%，表明此方法重復(fù)性較好。

1.3.5加樣回收試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取已知含量（5.198?mg/g）的黃芪粉末6份，各約2.5?g，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再分別精確加入適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，混勻后按照“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算出平均回收率為99.81%，RSD為0.805%。結(jié)果見表1。

1.3.6單因素試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)計(jì)以下單因素試驗(yàn)組合：①乙醇濃度為50%、60%、70%、80%和90%，水浴溫度為70?℃，料液比為1∶10，提取時(shí)間為2?h;②水浴溫度為60?℃、70?℃、80?℃、90?℃和100?℃，乙醇濃度為90%，料液比為1∶10，提取時(shí)間為2?h;③料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70?℃，提取時(shí)間為2?h;④提取時(shí)間為1?h、1.5?h、2?h、2.5?h和3?h，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70?℃，料液比為1∶10，分別考察以上各試驗(yàn)條件對黃芪總黃酮提取率的影響。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)“1.3.3”項(xiàng)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以黃芪總黃酮提取率為考量指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，選定的正交試驗(yàn)因素水平見表2。

1.4數(shù)據(jù)分析分別采用SPSS 18.0和Origin9.0軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)和繪圖。計(jì)算公式為[5]：

總黃酮提取率=（C×V）/（M×1000）×100

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL），V表示濾液體積（mL），M表示黃芪粉末質(zhì)量（g），×1000表示g與mg的單位轉(zhuǎn)換。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)圖1顯示，隨著乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間的增加，黃芪總黃酮的提取率均呈先升高后降低的趨勢，且分別在乙醇濃度為80%、水浴溫度為90?℃、料液比為1∶10和提取時(shí)間為2.5?h時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值。因此，選擇乙醇濃度70%、80%和90%，水浴溫度為80?℃、90?℃和100?℃，料液比為1∶8、1∶10和1∶12，提取時(shí)間為2?h、2.5?h和3?h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)由表3中R值（極差）可知，對黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比、乙醇濃度、水浴溫度和提取時(shí)間。從表中K1、K2、K3的大小分析得出，黃芪總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時(shí)間為2?h。此外，從表4方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度（P<0.001）、水浴溫度（P<0.01）、料液比（P<0.001）和提取時(shí)間（P<0.05）均顯著影響黃芪總黃酮的提取率。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)為驗(yàn)證組合A3B1C3D1為最優(yōu)提取方案，在此條件下，平行試驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果見表5，可以看出，在此最優(yōu)提取條件下，黃芪總黃酮的平均提取率為0.286%，均高于單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，表明該提取工藝參數(shù)A3B1C3D1（即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時(shí)間為2?h）合理可行，為黃芪總黃酮最優(yōu)提取方案。

3討論

相比于微波輔助萃取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法等，黃酮類物質(zhì)的乙醇回流提取法操作簡便、效率較高、溶劑可回收、運(yùn)行成本低，能夠同時(shí)兼顧提取效率和工業(yè)化生產(chǎn)[4，6]。本試驗(yàn)選擇乙醇回流提取法進(jìn)行黃芪總黃酮提取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法研究乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素對黃芪總黃酮提取率的影響，并通過直觀分析和方差分析綜合考察，確定黃芪總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)[6]。單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪總黃酮提取率均隨乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間的增加呈先升高后降低趨勢，表明影響總黃酮提取率的4個(gè)因素在選定范圍內(nèi)均存在顯著最佳值，當(dāng)各影響因素設(shè)定水平高于最佳值時(shí)，較高濃度的乙醇溶液使藥材中的低極性雜質(zhì)易于滲出[5]，造成類黃酮提取效率降低，高溫可破壞類黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)[4]，而料液比和提取時(shí)間的增加又導(dǎo)致生產(chǎn)成本以及提取周期提高[7];反之，當(dāng)各影響因素設(shè)定水平低于最佳值時(shí)，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的滲透、溶解和擴(kuò)散效率降低[8]，浸提物提取不充分。

試驗(yàn)研究結(jié)果表明，對黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比>乙醇濃度>水浴溫度>提取時(shí)間，同時(shí)總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時(shí)間為2?h，該提取條件下，黃芪總黃酮提取率為0.286%。此方法操作簡便、穩(wěn)定合理，可作為黃芪總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

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