帖余，李麗，劉軍*，附俊杰，王景峰，王國強，趙琦鍇

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢，643000)2(樂山恒峰華邦生物科技有限公司，四川 樂山，614000)

菜粕是菜籽榨油后的副產物，其中粗蛋白含量為35%～40%，與豆粕蛋白相比蛋氨酸和胱氨酸含量更高，且含有豐富的金屬元素，如鐵、錳、銅、鈣、磷、硒等，是一種價廉易得的優(yōu)質植物蛋白資源[1]。但菜粕中含有多種抗營養(yǎng)因子，如硫苷、植酸、芥酸和單寧酸等[2]，限制了其在食品、飼料行業(yè)中的應用。其中硫苷為主要的抗營養(yǎng)因子，分解后會生成惡唑烷硫酮、異硫氰酸酯、腈等有毒物質，這些物質對動物甲狀腺、肝、腎都會產生毒害作用[3]。植酸主要能與蛋白質、銅、鋅、鈣等營養(yǎng)物質結合形成難以消化的絡合物[4]，降低菜粕的營養(yǎng)價值。另一方面，由于菜粕蛋白中小肽含量低，相比于豆粕、魚粉蛋白更難被消化[5]。因此，降低菜粕中抗營養(yǎng)因子硫苷、植酸含量并提高小肽含量，對提高菜粕的營養(yǎng)價值，解決蛋白質原料供應緊缺的問題具有重要意義。

為了改善菜籽粕的營養(yǎng)價值，國內外許多學者對菜粕的脫毒方法進行了大量研究，包括物理脫毒法、化學脫毒法、微生物發(fā)酵法和遺傳育種法。微生物固態(tài)發(fā)酵法經濟高效、重現(xiàn)性好[6]，近年來常被用于菜粕脫毒、提取菜籽抗氧化肽等[7-8]。CROAT等[9]利用正己烷預處理菜粕后，通過里氏木霉30 ℃發(fā)酵168 h后將菜粕中硫苷降至0.4 μmol/g。但存在有機試劑殘留，發(fā)酵時間長等問題。MAHAJAN等[10]通過添加純酶制劑降解植酸、硫苷，其降解率分別達到71%、60%。但通過添加純酶制劑處理菜粕降解抗營養(yǎng)因子，一方面降低了酶和底物的耦合度使得酶解效率低下，另一方面也增加了處理成本。

目前大部分研究側重于通過微生物一步發(fā)酵法降解抗營養(yǎng)因子[11-13]，但未考察過通過發(fā)酵后結合酶解的方式進一步降解菜粕中抗營養(yǎng)因子，提高營養(yǎng)物質。由于黑曲霉具有產酶系較全且安全性高的特點[14]，并符合農業(yè)部頒布的安全發(fā)酵菌株要求，因此，本實驗選擇一株能降解硫苷、植酸的黑曲霉發(fā)酵菜粕，發(fā)酵結束后利用黑曲霉在發(fā)酵過程中產生的各種酶進一步酶解發(fā)酵后的菜粕，通過發(fā)酵、酶解兩步法降低菜粕中的抗營養(yǎng)因子硫苷和植酸含量，提高菜粕中小肽含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉,購買于中國工業(yè)菌種保藏中心(CICC)。

1.1.2 原料

菜籽粕(水分含量10.57%)、麩皮(水分含量9.31%),樂山恒峰華邦科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基：察氏瓊脂培養(yǎng)基(質量分數(shù))(蔗糖3%；NaNO30.3%；K2HPO40.1%；MgSO4·7H2O 0.05%；KCl 0.05%；FeSO40.001%；瓊脂1.5%～2%；121 ℃滅菌20 min)。

黑曲霉麩皮種子培養(yǎng)基：麩皮∶水=2∶1 (g∶mL)，自然pH；混勻取 30 g裝于500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕(絕干)∶麩皮(絕干)∶水=7∶3∶15 (g∶g∶mL)，自然pH；混勻取 60 g裝于500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器設備

T-114型分析天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；T6紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；QYC-2102C型恒溫培養(yǎng)搖床,上海福馬實驗設備有限公司；MF 80BSH-2型霉菌培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LS-75HD立式高壓蒸汽滅菌器,江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；SW-CJ-2F 型超級潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；K9840自動凱氏定氮儀,山東海能科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子制備

勾取5～7環(huán)保藏的黑曲霉接種于種子培養(yǎng)基中，混勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

將黑曲霉麩皮種子以5%(質量分數(shù))的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)；發(fā)酵一定時間后取30 g發(fā)酵菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩網測定指標。

1.3.3 酶解

取固態(tài)發(fā)酵結束后的30 g發(fā)酵菜粕裝入自封袋，45 ℃密閉恒溫酶解24 h；之后將菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩網測定指標。

1.3.4 發(fā)酵、酶解時間對硫苷、植酸含量的影響

固態(tài)發(fā)酵時間：分別考察發(fā)酵一定時間(12、24、36、48、60、72 h)和發(fā)酵相應時間并酶解24 h后硫苷、植酸含量的變化情況。

酶解時間：考察經一定時間發(fā)酵并經過不同時間(0、6、12、18、24、30、36 h)酶解后硫苷、植酸含量的變化情況。

1.3.5 底物組成、表面活性劑、初始發(fā)酵水分對硫苷、小肽含量及產酶的影響

底物組成：考察發(fā)酵底物中麩皮與菜粕的比例(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6)對發(fā)酵后產酶及酶解后硫苷、小肽含量的影響。

表面活性劑：考察含水混合發(fā)酵底物中不同吐溫80添加量(質量分數(shù)0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)對發(fā)酵后產酶及酶解后硫苷、小肽含量的影響。

初始發(fā)酵水分：考察不同初始發(fā)酵水分(51%、55%、59%、63%、67%、71%)對發(fā)酵后產酶及酶解后硫苷、小肽含量的影響。

1.3.6 理化指標測定

硫苷按照氯化鈀法[15]測定。

植酸按照文獻[16-17]測定。

小肽按照文獻[18]測定；蛋白質含量測定按照凱氏定氮法。

酸性蛋白酶活按照文獻[19]測定。

CMC酶活按照文獻[20]測定。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，用Duncan檢驗法進行顯著性多重比較，試驗結果采用平均值±標準誤差表示，以P<0.05作為差異性顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵時間對硫苷、植酸含量變化的影響

如表1所示，經過酶解后，硫苷，植酸含量相比于單步固態(tài)發(fā)酵明顯降低，且發(fā)酵時間對降解硫苷、植酸的影響十分明顯。發(fā)酵前36 h，硫苷、植酸含量基本不變，發(fā)酵至48 h時硫苷含量降至最低；當發(fā)酵時間超過48 h，植酸含量隨發(fā)酵時間的增加而下降，但硫苷含量隨發(fā)酵時間增加。將經過各時間發(fā)酵后的菜粕進一步酶解，相比于單步發(fā)酵，除發(fā)酵12 h外，硫苷、植酸含量均明顯降低。發(fā)酵48 h后繼續(xù)酶解24 h，硫苷含量降至最低，相比于固態(tài)發(fā)酵降低了30.51%，植酸含量降解至1 mg/g以下。

表1 發(fā)酵時間對降解硫苷、植酸含量的影響Table 1 Effect of fermentation time on degrading glucosinolates and phytic acid

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

發(fā)酵前36 h，黑曲霉產生降解硫苷、植酸的酶量少，經酶解后只有少量硫苷、植酸被降解；發(fā)酵至36～48 h，黑曲霉大量分泌降解硫苷、植酸的酶，經酶解后硫苷、植酸均降至最低水平；發(fā)酵60～70 h后酶解，硫苷含量相比于發(fā)酵48 h后酶解顯著增加(P<0.05)。到發(fā)酵后期，碳水化合物被大量消耗，蛋白質成分富集[21]，也可能導致硫苷含量相對增加。發(fā)酵48 h后酶解的硫苷、植酸含量均處于最低水平，因此選擇48 h為最佳發(fā)酵時間。

2.2 酶解時間對硫苷植酸含量變化的影響

將發(fā)酵的菜粕繼續(xù)酶解后，硫苷和植酸進一步被降解，結果如表2所示。經過6 h酶解后，相比于黑曲霉單獨發(fā)酵48 h，植酸含量降低了69.88%；酶解12 h后，植酸含量從1.40%降低至0.1%以下，王曉東等[22]使用黑曲霉單步固態(tài)發(fā)酵菜粕將植酸從2.81%降低至0.63%，本研究結果優(yōu)于王曉東等[22]的研究結果。酶解前12 h，硫苷降解速率較快，12 h后降解速率相對減慢?？赡苁怯捎?2 h后，可降解的底物濃度減少且45 ℃保溫時間過長使相關酶酶活下降，從而導致硫苷降解速率下降。當經過24 h酶解后，硫苷含量降低至12.13 μmol/g，且不隨酶解時間增加而變化(P>0.05)。

表2 酶解時間對降解硫苷、植酸含量的影響Table 2 Effect of enzymatic hydrolysis time on degrading glucosinolates and phytic acid

發(fā)酵過程中，黑曲霉產生的植酸酶可能受到溫度及底物平衡等條件限制導致植酸降解效果不好。當酶解溫度升高時，植酸酶分解植酸的能力也有較顯著的提高，且植酸的降解不受黑曲霉生長代謝影響，因而使得大量植酸易在短時間內被分解。與降解植酸不同，可能在黑曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中產生的分解硫苷的酶類有限[23]，因此在酶解過程中不能將硫苷完全降解。再經過24 h酶解后硫苷和植酸含量均不再發(fā)生變化，因而選擇酶解24 h為最佳酶解時間。由于經酶解后，植酸幾乎完全降解，因此后續(xù)研究主要通過優(yōu)化菌酶協(xié)同條件進一步降解硫苷，同時提高小肽含量。

2.3 底物組成對降解硫苷提高小肽含量的影響

麩皮作為一種良好的碳源及營養(yǎng)物質，適量混入菜粕中能使底物變得疏松透氣，有利于黑曲霉在發(fā)酵過程中生長產酶[24]。如圖1-a所示，麩皮∶菜粕=2∶8和3∶7時，黑曲霉發(fā)酵酶解后硫苷含量差異不顯著(P>0.05)，且當麩皮∶菜粕=3∶7時，菜粕中的小肽含量最高(P<0.05)。如圖1-b所示，麩皮∶菜粕=3∶7時，黑曲霉發(fā)酵后蛋白酶活最高，因此麩皮∶菜粕=3∶7可能是黑曲霉生長產酶最適碳氮比。因為麩皮∶菜粕=3∶7時黑曲霉產蛋白酶活最高，所以酶解后小肽含量也最高。當麩皮比例超過底物的40%后，可能因為麩皮的添加量增大使得發(fā)酵底物中硫苷及可降解的大分子蛋白質含量相對減少，導致硫苷及小肽含量均呈現(xiàn)下降趨勢。綜上，麩皮∶菜粕=3∶7有利于降解硫苷及提高小肽含量和產酶量，因此確定麩皮與菜粕的比例為3∶7。

圖1 底物組成對硫苷、小肽含量及蛋白酶活的影響Fig.1 Effect of substrate composition on glucosinolates,small peptide content and protease activity

2.4 添加表面活性劑對降解硫苷，提高小肽含量的影響

在菜粕與麩皮的混合底物中加入適量的吐溫80有利于提高蛋白酶酶活和小肽含量，結果如圖2-a所示。當在麩皮菜粕混合底物中添加0.05%的吐溫80進行發(fā)酵酶解后，小肽含量明顯增加，相比于未添加吐溫80，小肽含量提高了42.66%，但硫苷含量無明顯差異(P>0.05)，可能由于菜粕中剩余的硫苷種類無法被此株黑曲霉產生的酶分解，因此硫苷含量變化不大。圖2-b結果表明，小肽含量變化與蛋白酶活變化趨勢相似。黑曲霉在含有0.05%～0.2%吐溫80的混合底物發(fā)酵后，酸性蛋白酶顯著提高，再經酶解后，菜粕中大分子蛋白質進一步被分解為小分子肽，因此小肽含量顯著提高。由于添加0.05%～0.2%的吐溫80對小肽及硫苷含量無顯著影響(P>0.05)，因此確定吐溫80最適添加量為0.05%。

圖2 吐溫80添加量對硫苷、小肽含量及蛋白酶活的影響Fig.2 Effect of addition of tween 80 on glucosinolates,small peptide content and protease activity

2.5 初始發(fā)酵水分對降解硫苷提高小肽含量的影響

如圖3-a所示，當初始發(fā)酵水分低于67%時，小肽含量隨水分增加而增加，當水分超過67%時，小肽含量明顯下降(P<0.05)。初始水分在55%～71%，經發(fā)酵酶解后，硫苷含量無明顯變化(P>0.05)。圖3-b結果表明，初始水分的變化對蛋白酶活的影響不顯著(P>0.05)，且酶解后，小肽含量的變化與蛋白酶活的變化趨勢不同。根據(jù)WANG等[25]報道，菜粕中的蛋白質被纖維素形成的結構所包裹，在酶解過程中，小肽的產生可能也受纖維素酶影響。因此當水分過高時，纖維素酶活力下降(圖3-b)，導致酶解后小肽含量下降。雖然黑曲霉于67%的初始水分發(fā)酵酶解后小肽含量最高，但由于水分過高，底物結團嚴重，且易污染雜菌，不利于擴大生產，因此確定最佳的初始發(fā)酵水分為59%～63%，為方便后續(xù)試驗，確定最佳初始發(fā)酵水分為60%。

圖3 初始發(fā)酵水分添加量對硫苷、小肽含量及蛋白酶、CMC酶酶活的影響Fig.3 Effect of initial fermentation moisture on glucosinolates,small peptide content and protease,CMCase activity

2.6 滅菌和不滅菌對發(fā)酵酶解后營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子含量的影響

表3結果表明，黑曲霉在滅菌與不滅菌的菜粕麩皮混合培養(yǎng)基(初始發(fā)酵水分60%、吐溫80添加量0.05%)中發(fā)酵酶解后，除小肽含量外，硫苷、植酸、粗蛋白含量均無明顯差異(P>0.05)。

表3 滅菌與不滅菌對發(fā)酵酶解后營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子含量的影響Table 3 Effect of non-sterile and sterile conditions on antinutritional and nutritional components

同時結果表明，未滅菌發(fā)酵對硫苷、植酸的降解及小肽含量的提高效果均優(yōu)于滅菌后發(fā)酵，推測由于滅菌后導致培養(yǎng)基中部分營養(yǎng)成分流失，使得黑曲霉發(fā)酵效果變差。最終經未滅菌的麩皮菜粕混合培養(yǎng)基發(fā)酵酶解后，硫苷含量從31.38 μmol/g降解為11.31 μmol/g，植酸含量從34.45 mg/g降低至1 mg/g以下，小肽含量提高至21.19%，占粗蛋白含量的49.92%。

3 結論

通過對發(fā)酵、酶解時間，發(fā)酵酶解、產酶條件優(yōu)化后，確定了最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵時間、酶解時間分別為48 h、24 h，菜粕與麩皮比例、吐溫80添加量、初始發(fā)酵水分分別為7∶3、0.05%、60%。與單步固態(tài)發(fā)酵相比，經菌酶協(xié)同處理的菜粕，硫苷、植酸含量分別降低了33.20%、96.18%；與空白對照相比，硫苷、植酸含量分別降低了63.96%、97%以上；同時，菜粕中小肽含量提高至21.19%，相比于空白和單步發(fā)酵分別提高了74.98%和673.36%。綜上，菌酶協(xié)同處理菜粕后，有效降低了菜粕中抗營養(yǎng)因子硫苷、植酸含量，大幅提高了小肽含量，對擴大菜粕蛋白的使用具有重要意義。