何鳳媛 譚博 趙琳 李貴華

[摘要] 目的 探討抗人免疫缺陷病毒（HIV）酶聯(lián)免疫試驗(yàn)結(jié)果的影響因素，提高篩選檢查準(zhǔn)確性，為艾滋病的防控工作提供快速準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。方法 抽取2017年間送檢至實(shí)驗(yàn)室的患者血清樣本300例，進(jìn)行回顧性分析，采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)進(jìn)行初篩選，由市疾控中心對其進(jìn)行確認(rèn)，同時對試驗(yàn)中所用試劑、標(biāo)本、操作進(jìn)行詳細(xì)分析。結(jié)果 在檢測的樣本中，上報20例，確認(rèn)陽性15例，確認(rèn)陰性4例，1例為HIV抗體不確定。結(jié)論 臨床應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書以及試劑操作要求規(guī)范試驗(yàn)操作，提高酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測HIV篩選準(zhǔn)確率，確保實(shí)驗(yàn)前后質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 酶聯(lián)免疫試驗(yàn);人類免疫缺陷病毒;影響因素;質(zhì)量控制

[中圖分類號] R512 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-5654（2019）08（a）-0020-03

Study on the Influencing Factors of the Results of HIV Antibody-linked Immunosorbent Assay

HE Feng-yuan， TAN Bo， ZHAO Lin， LI Gui-hua

Chengdu Pidou District Center for Disease Control and Prevention， Chengdu， Sichuan Province， 610000 China

[Abstract] Objective To investigate the influencing factors of anti-human immunodeficiency virus（HIV） enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， improve the accuracy of screening and examination， and provide a fast and accurate scientific basis for the prevention and control of AIDS. Methods A total of 300 patients with serum samples sent to the laboratory during 2017 were selected for retrospective analysis. The initial screening was performed by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， which was confirmed by the Municipal CDC. At the same time， the reagents， specimens and operations used in the test were used and a detailed analysis was implemented. Results Of the samples tested， 20 case were reported， 15 case were positive， 4 case were negative， and 1 case was HIV antibody. Conclusion The clinical practice should be strictly in accordance with the instructions of the kit and the operation requirements of the reagents， and the accuracy of HIV screening should be improved by enzyme-linked immunoassay to ensure the quality control before and after the experiment.

[Key words] Enzyme-linked immunosorbent assay; Human immunodeficiency virus; Influencing factors; Quality control

艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），又名獲得性免疫缺陷綜合征，是由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。據(jù)中國疾控中心、聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織聯(lián)合評估，截至2018年底，全人群艾滋病病毒感染率約為9.0/萬，估計(jì)新發(fā)感染者每年8萬例左右，感染者增加速度沒有減慢，準(zhǔn)確并且快速檢測艾滋病十分重要。目前，常用方法初篩方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)、快速檢測（RT）及其他檢測試驗(yàn)。其中ELISA試劑盒使用最為廣泛，它具有準(zhǔn)確性高、價格低廉、判斷結(jié)果又客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)[1]。但酶聯(lián)免疫試驗(yàn)需大量手工操作，因此易受到多種因素影響，導(dǎo)致結(jié)果存在偏差。為了進(jìn)一步提高酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測準(zhǔn)確性，該文對HIV抗體酶聯(lián)免疫試驗(yàn)結(jié)果的常見影響因素進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

抽取2017年間送檢至實(shí)驗(yàn)室的患者血清樣本300例。

1.2? 方法

所有患者均于清晨采取3～5 mL靜脈血，盡量避免溶血，非抗凝血自然凝固1～2 h后，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，制備標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測24 h。將酶復(fù)合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性、陽性對照。經(jīng)過1 h的孵育，然后洗板，加底物，30 min避光反應(yīng)后加終止液即完成反應(yīng)部分。使用北京萬泰試劑以及深圳愛康全自動酶免儀，在實(shí)施檢測過程中，根據(jù)試劑使用說明書以及儀器操作指導(dǎo)進(jìn)行操作，提高質(zhì)量管控力度。當(dāng)檢測結(jié)果顯示陰性，則出具詳細(xì)陰性報告;當(dāng)顯示陽性，則應(yīng)將檢測結(jié)果送至市疾控中心艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)，整個過程做好保密工作。之后讀數(shù)，由數(shù)值來判斷結(jié)果的陰性或陽性。

2? 結(jié)果

全自動酶免儀設(shè)為2個陰性對照孔，平均OD值不超過0.1，同時2個陽性對照孔OD值不小于0.8，陽性對照孔OD值與臨界值相差0.12，當(dāng)實(shí)驗(yàn)檢測吸光度不在陰陽限定范圍內(nèi)時，即可對相關(guān)原因進(jìn)行判定，重新檢測予以確認(rèn)。在檢測的樣本中，上報20例，確認(rèn)陽性15例，4例確認(rèn)為試驗(yàn)陰性，1例為HIV抗體不確定。

3? 討論

酶聯(lián)免疫試驗(yàn)特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，但檢測結(jié)果易受多種因素影響，優(yōu)質(zhì)試劑、標(biāo)準(zhǔn)化儀器、規(guī)范操作方法、高素質(zhì)技術(shù)人員均是保障試驗(yàn)順利進(jìn)行的不可缺少的條件。其中任何一項(xiàng)均可能導(dǎo)致檢測結(jié)果假陰性或者假陽性的出現(xiàn)，影響后續(xù)工作。因此，臨床應(yīng)加強(qiáng)管控HIV抗體初篩查質(zhì)量，確保結(jié)果準(zhǔn)確性。經(jīng)大量臨床實(shí)踐分析[2]，現(xiàn)將影響因素歸結(jié)為下幾方面。

3.1? 試劑因素

3.1.1 試劑的選擇? 檢測結(jié)果質(zhì)量是建立在優(yōu)質(zhì)HIV抗體試劑基礎(chǔ)上的。選擇優(yōu)質(zhì)試劑考慮因素眾多，例如靈敏度、特異性、緊密度、安全性、簡單性等，做出全面客觀評估，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體情況選擇靈敏度高、特異性強(qiáng)試劑。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過廠家詳細(xì)了解試劑包被物組成成分，包括原料來源、片段組成、片段長短等多項(xiàng)內(nèi)容[3]，進(jìn)而判斷抗原、抗體包被完整性與特異性，查看試劑批號具體了解試劑質(zhì)量水平與優(yōu)劣，客觀、合理選擇實(shí)驗(yàn)室試劑。注意訂購長效批號試劑，以免發(fā)生批號改變時重建質(zhì)量管控體系。

3.1.2 試劑的準(zhǔn)備? 在臨床實(shí)驗(yàn)中常常忽略了試劑的準(zhǔn)備程序，將試劑從冰箱中拿出來便立即使用，而該做法可能影響后續(xù)工作步驟時間，這可能導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本出現(xiàn)假陰性結(jié)果[4]。實(shí)驗(yàn)前因?qū)⒃噭?～8℃冰箱取出后放置室溫約20～30 min，待試劑盒與室溫平衡后再進(jìn)行檢測，使反應(yīng)微孔中溫度滿足檢測所需，避免試劑溫度引起的結(jié)果偏差。

3.2? 樣本因素

①當(dāng)樣本存在嚴(yán)重溶血或混有紅細(xì)胞血清時，極易附著在聚乙烯孔內(nèi)，清洗困難，未清洗干凈的血紅蛋白具有過氧化物酶活性，作用于催化底物造成假陽性，因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格禁止使用嚴(yán)重溶血標(biāo)本。

②受污染標(biāo)本中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)特異性顯色。因此，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)應(yīng)采集新鮮標(biāo)本。如果未能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在5 d之內(nèi)將試劑放置于4℃保存，若安排1周后檢測應(yīng)在低溫下凍存[5]。在收集標(biāo)本試劑時堅(jiān)持使用無菌試管，有效防止污染試管。長期未使用試劑反復(fù)放置于冰凍保存中，其過程中存生機(jī)械剪切力對于蛋白質(zhì)分子具有破壞力，造成檢測結(jié)果假陰性。因此，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)應(yīng)盡量采用新鮮標(biāo)本，避免長時間反復(fù)融凍樣本。

③標(biāo)本凝固不全。正常情況下，采集血液于30 min～2 h開始凝固，在18～24 h開始完全收縮。有時為了爭取實(shí)驗(yàn)時間，在血液未凝固時便開始進(jìn)行離心處理，血清中仍殘留部分纖維蛋白原。在實(shí)驗(yàn)過程中形成明顯纖維蛋白塊，附著于酶物標(biāo)孔壁內(nèi)，不易清洗，導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性或假陰性。因此，應(yīng)充分凝固血液標(biāo)本后再進(jìn)行分離處理?；蛘呤褂脦Х蛛x膠的采血管采集標(biāo)本，也可以在采血管中加入適當(dāng)促凝劑。

3.3? 控制方法

①加樣。規(guī)范加樣操作，垂直滴加試劑，禁止出現(xiàn)傾斜、人為加大試劑量。加樣吸嘴工具是否干凈以及吸取試劑量多少對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性具有直接影響。吸嘴構(gòu)造特殊，清洗困難，極易發(fā)生交叉污染。推薦使用一次性吸嘴[6]。定期清洗加樣器并做好校準(zhǔn)工作。每人均具有1個移液頭，以免出現(xiàn)交叉污染。標(biāo)本加于微孔底部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

②溫育。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特殊，易發(fā)生邊緣效應(yīng)。經(jīng)研究證明抗原抗體結(jié)合、酶促反應(yīng)對于溫度均具有較高敏感性。酶際板周圍以內(nèi)部孔升溫、降溫度速率方面存在差異[7]，進(jìn)而導(dǎo)致周邊與內(nèi)部孔顯示結(jié)果不同。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)最佳條件為水浴，溫浴時間應(yīng)準(zhǔn)確按照定力要求，嚴(yán)格控制溫箱溫度，盡量保持溫育過程，避免發(fā)生邊緣效應(yīng)[8]。

③洗板。洗滌在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中具有重要作用，手洗條件較差，加大誤差出現(xiàn)率，半自動或者全自動洗板機(jī)，當(dāng)未規(guī)范操作時，也會出現(xiàn)結(jié)果誤差。殘留纖維蛋白絲、洗滌液中析出結(jié)晶體均可能不同程度堵塞洗板機(jī)針小孔，未能完全洗脫，出現(xiàn)“花板”，造成檢測結(jié)果假陽性或者假陰性[9]。因此，應(yīng)注重矯正洗板機(jī)洗板時注射量以及殘液量，在結(jié)束后使用蒸餾水進(jìn)行清洗。將蒸餾水注滿每個反應(yīng)孔，確保殘液量小于2 μL，拍干。為了進(jìn)一步提高洗滌效果，在實(shí)驗(yàn)過程中，可以將機(jī)器洗滌與人工洗滌相結(jié)合，首先進(jìn)行機(jī)洗，再進(jìn)行1～2次人工洗板，也可以根據(jù)實(shí)際情況合理增加洗地板數(shù)量。

3.4? 顯色

在終止顯色中應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范操作程序，在顯色終止15分鐘內(nèi)讀取酶標(biāo)儀顯示數(shù)據(jù)，注意禁止將酶標(biāo)儀放置于陽光或者強(qiáng)光照射下，在進(jìn)行預(yù)熱15～30 min后再開始進(jìn)行操作。顯色淺情況下，肉眼難以觀察，影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

3.5? 質(zhì)控

每批測試結(jié)果可以通過試劑盒陰陽性對照，室內(nèi)質(zhì)控品質(zhì)控，同時做好質(zhì)控圖，以便于判斷檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，對于異常結(jié)果應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換廠家試劑盒對樣品進(jìn)行復(fù)查，并及時與臨床主治醫(yī)師溝通交流。

綜上所述，HIV抗體酶聯(lián)免疫試驗(yàn)操作簡單，但影響結(jié)果因素具有多樣化，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性或者假陽性。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中要求加強(qiáng)質(zhì)量管控工作，要求檢驗(yàn)人員嚴(yán)格遵守試劑盒說明書和檢測技術(shù)規(guī)范，盡可能避免或者減少影響因素的發(fā)生，提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，為艾滋病的防控工作提供快速準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。

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