肖煒卓 張龍 王曉冬 張保榮

[摘要] 目的 分析慢性牙周炎齦下菌斑的轉(zhuǎn)錄組，探究齦下菌斑群落在慢性牙周炎發(fā)病過稱中的變化。 方法 選取2017年1月～2018年1月在航空總醫(yī)院口腔科診斷為慢性牙周炎并滿足納入條件的7例的齦下菌斑患者，提取相關(guān)RNA，進(jìn)行微量RNA建庫。應(yīng)用高通量二代測序技術(shù)，對其宏轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，觀察相關(guān)菌群基因表達(dá)情況。 結(jié)果 慢性牙周炎齦下菌斑中，文氏密螺旋體的基因序列高度表達(dá)。與牙周炎發(fā)生關(guān)系密切的同源蛋白質(zhì)家族中，最多的表達(dá)基因序列與細(xì)菌的翻譯相關(guān)。而碳水化合物活性酶相關(guān)的基因表達(dá)中，表達(dá)最多的是碳水化合物相關(guān)結(jié)構(gòu)域基因序列和糖苷水解酶基因序列。 結(jié)論 通過宏轉(zhuǎn)錄組的測序分析，了解慢性牙周患者齦下菌斑中不同細(xì)菌基因表達(dá)情況及相關(guān)細(xì)菌生理代謝的基因表達(dá)，從而對牙菌斑的致病性提出新的研究方法和意見，加深對菌斑致病性的理解。

[關(guān)鍵詞] 慢性牙周炎;齦下菌斑;轉(zhuǎn)錄組;高通量測序

[中圖分類號] R781? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0021-04

Macrotranscriptome analysis of subgingival plaque in patients with chronic periodontitis

XIAO Weizhuo1*? ?ZHANG Long2*? ?WANG Xiaodong3? ?ZHANG Baorong1，3

1.School of Stomatology， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang? ?261000， China; 2.Department of Stomatology， University of Chinese Academy of Sciences， Shenzhen Hospital， Guangdong Province， Shenzhen? ?518000， China; 3.Department of Stomatology， Aviation General Hospital， Beijing? ?100012， China

[Abstract] Objective To analyze the transcriptome of subgingival plaque in chronic periodontitis and explore the changes of subgingival plaque community in chronic periodontitis. Methods From January 2017 to January 2018， 7 cases of subgingival plaque patients diagnosed as chronic periodontitis in the Department of Stomatology of Aviation General Hospital and meeting the inclusion conditions were selected. Relevant RNA was extracted and trace RNA was used to build a database. High-throughput second-generation sequencing technology was used to analyze the macrotranscriptome and the gene expression of related bacteria was observed. Results In the subgingival plaque of chronic periodontitis， the gene sequence of Venn treponema was highly expressed. Among the homologous protein families closely related to periodontitis， the most expressed gene sequences were related to bacterial translation. Among the active carbohydrate enzyme-related genes， the most expressed ones were the sequences of carbohydrate related domain genes and glycoside hydrolytic enzyme genes. Conclusion Macrotranscriptome sequencing analysis is conducted to understand the gene expression of different bacteria in subgingival plaque of chronic periodontitis patients and the gene expression of related bacteria physiological metabolism， so as to propose new research methods and opinions on the pathogenicity of dental plaque， and deepen the understanding of the pathogenicity of plaque.

[Key words] Chronic periodontitis; Subgingival plaque; Transcriptome; High-throughput sequencing

牙周炎是由牙菌斑及其代謝產(chǎn)物引起牙周支持組織喪失的慢性炎癥疾病，其發(fā)病率在80%～90%[1-2]。牙周炎的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關(guān)[3-5]，牙周組織破壞是由牙齦下生物膜中的致病性微生物群引起的[6-7]。

牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的大部分微生物很難培養(yǎng)或不能培養(yǎng)[8-9]，導(dǎo)致其基因表達(dá)分析還不夠完善。因此，探究牙周炎病因的關(guān)鍵是對牙菌斑及其代謝產(chǎn)物在發(fā)病過程中的變化[10-11]。近年來，借助新一代DNA測序技術(shù)的宏轉(zhuǎn)錄學(xué)在牙周炎致病性的相關(guān)研究成為了熱點[12-14]。本研究基于二代測序技術(shù)對慢性牙周炎患者齦下菌斑的宏轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，從宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度對慢性牙周炎的病因進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

1.1.1 主要儀器

RNeasy mini kit RNA提取試劑盒（QIAGEN公司，貨號：74104）、Illumina HiSeqTM 2000（深圳華大，型號：SY-401-1001）、生物芯片掃描儀（安捷倫科技公司上海，型號：Agilent2100）、Hanks液（北京諾博萊德，貨號：C0832）干冰若干、冰盒、高速離心機(jī)（Thermo scientific公司，型號：Sorvall Legend Micro 21R）、超凈實驗臺（蘇州凈化設(shè)備儀器廠，型號：SW-CJ-1F）;50 bp marker（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，貨號：TSJ050-500）;無水乙醇、氯仿等（天津外環(huán)化工廠）;dNTP mixture（TaKaRa公司，貨號：4019）。

1.1.2 試劑調(diào)配

D-hank溶液調(diào)配及pH調(diào)節(jié)，見圖1。

1.2 方法

選取2017年1月～2018年1月在航空總醫(yī)院口腔科診斷為慢性牙周炎7例齦下菌斑患者，采樣前進(jìn)行牙周炎程度評估，如探診深度、牙周袋深度（PD）、附著喪失程度（AL）、以及探針出血情況（BOP）等[15]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：25～60歲，診斷為慢性牙周炎并天然牙不少于16顆，每個象限都有天然牙，至少有1個位點牙周袋深度>6 mm;排除標(biāo)準(zhǔn)：3個月內(nèi)有牙周治療，服用抗生素藥物，全身性疾病史（糖尿病等），在妊娠期及哺乳期等情況。

1.2.1 患者齦下菌斑樣品的采集

將每個樣品溶于1.0 mL調(diào)配好的D-hank溶液，分裝到1.5 mL厭氧運(yùn)輸管內(nèi)，立即進(jìn)行-80℃冷凍，同時記錄取樣位點PD、AL和BOP[16]。具體記錄標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序前準(zhǔn)備

采用RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。見圖2。

1.2.2.1 提取樣品的RNA質(zhì)量濃度測定? 將提取后的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測評估。提取RNA總量在0.2032～1.3759 μg，RIN值為2.2～2.9，總體符合RNA建庫要求[17]。提示提取獲得的RNA質(zhì)量和良好，比較完整，降解少。符合轉(zhuǎn)錄組建庫要求，可以按照此樣本建庫、取樣、實驗。見表2。

1.2.2.2 cDNA文庫建立以及DNA合成? cDNA文庫建立按照圖3進(jìn)行，將得到的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 高通量測序

與傳統(tǒng)測序方法[19]比較，本研究是邊合成邊測序，一次性可以處理幾百上千萬的數(shù)據(jù)量，能夠短時間內(nèi)對所獲得短序列拼接、測序。

2 結(jié)果

為了保證結(jié)果一致性，所有序列的比對均使用BLAST（version 2.2.21）軟件對比到各個數(shù)據(jù)庫來完成。主要數(shù)據(jù)庫包括：非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（nonredundant database，NR）[20]、碳水化合物利用相關(guān)酶類數(shù)據(jù)庫（Carbohydrate-Active enzymes database，CAZy）[21]、同源聚簇蛋白數(shù)據(jù)庫（cluster of orthologous groups of proteins，COG）[22]。

2.1 基于NR數(shù)據(jù)庫比較

將基因序列（merge-unigene）通過BLAST軟件NCBI的NR蛋白數(shù)據(jù)庫，在慢性牙周炎患者齦下菌斑中主要細(xì)菌比例如圖4a（封四）所示。其中文氏螺旋體的RNA含量最高，大約為齒垢密螺旋體的3倍。

2.2 基于COG數(shù)據(jù)庫的功能注釋

將基因序列與COG蛋白庫比較，并進(jìn)行COG數(shù)據(jù)庫的蛋白功能注釋。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫功能比對發(fā)現(xiàn)含量最豐富的是與細(xì)菌翻譯相關(guān)的過程。而在RNA加工，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)核動力等方面的相關(guān)功能蛋白和序列基因卻很少。見圖4b（封四）。

2.3 基于CAZy功能庫的功能注釋

將merge-unigene對比分析到CAZy，發(fā)現(xiàn)merge-unigene最多的兩類碳水化合物酶是碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（43）和糖苷水解酶（34）。但是與多糖裂解酶相關(guān)的merge-unigene數(shù)量為0。

3 討論

慢性牙周炎患者齦下菌斑轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在疾病活動期，文氏螺旋體的含量并不高，但其參與疾病的過程要高于齒垢密螺旋體。分析發(fā)現(xiàn)，文氏螺旋體具有其他細(xì)菌不具備的運(yùn)動方式，它可以通過鞭毛利用能量來改變自己的運(yùn)動軌跡，具備主動遷移的能力?？梢詤f(xié)同其他可以產(chǎn)生強(qiáng)的致病因子以及組織破壞的微生物對牙周破壞部位進(jìn)行遷移，加劇深部牙周組織的破壞，使牙周的微環(huán)境更有利于疾病的發(fā)生發(fā)展，這為治療牙周疾病提出了新方向。

基于COG數(shù)據(jù)庫的對比說明在慢性牙周炎患者的齦下菌斑群落中，微生物的翻譯過程占據(jù)主導(dǎo)。所以要想改變慢性牙周炎疾病的發(fā)生發(fā)展過程，就需要從破壞菌斑中群落的能量代謝，機(jī)械性防御以及翻譯構(gòu)成，降低群落整體的活動性，從而阻止疾病的進(jìn)展。

通過CAZy數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者的齦下菌斑群落中，群落對于單糖的水解利用會比較活躍，而對于多糖的利用，則缺乏相關(guān)性酶。成熟的菌斑群落必須依靠宿主口腔內(nèi)的多糖酶將多糖水解為單糖或者雙糖之后才能加以利用。因此，清潔牙周袋環(huán)境的內(nèi)容物在進(jìn)行牙周炎的系統(tǒng)綜合治療后尤為必要。

試驗嘗試進(jìn)行微量建庫，在樣品量達(dá)不到常規(guī)建庫要求的前提下，未采用通常意義上先擴(kuò)增，分離純化后再建庫的方法。后續(xù)分析證明，微量建庫的原則和方法同樣適用于口腔復(fù)雜樣本的處理和分析。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Holtfreter B，Albandar JM，Dietrich T，et al. Standards for reporting chronic periodontitis prevalence and severity in epidemiologic studies：Proposed standards from the Joint EU/USA Periodontal Epidemiology Working Group [J]. J Clin Periodontol，2015，42（5）：407-412.

[2]? 王輝，劉東旭.老年人牙周病患病情況及其影響因素分析[J].山東醫(yī)藥，2016，56（12）：94-95.

[3]? Marsh PD. In Sickness and in Health—What Does the Oral Microbiome Mean to Us？ An Ecological Perspective [J]. Adv Dent Res，2018，29（1）：60-65.

[4]? Moon JH，Lee JH，Lee JY. Subgingival microbiome in smokers and non-smokers in Korean chronic periodontitis patients [J]. Mol Oral Microbiol，2015，30（3）：227-241.

[5]? 曹采方.牙周病學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003， 127-128.

[6]? Hajishengallis G. Periodontitis：from microbial immune subversion to systemic inflammation [J]. Nat Rev Immunol，2015，15（1）：30-44.

[7]? Silva N，Abusleme L，Bravo D，et al. Host response mechanisms in periodontal diseases [J]. J Appl Oral Sci，2015， 23（3）：329-355.

[8]? Wade WG. Has the use of molecular methods for the characterization of the human oral microbiome changed our understanding of the role of bacteria in the pathogenesis of periodontal disease [J]. J Clin Periodontol，2011，38（Suppl 11）：7-16.

[9]? Kinane DF，Stathopoulou PG，Papapanou PN. Periodontal diseases [J]. Nat Rev Dis Primers，2017，3：17038.

[10]? 薛晶，肖麗英，周學(xué)東.人體口腔微生物組研究最新進(jìn)展[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，28（1）：5-8.

[11]? 李燕，何金枝，肖麗英，等.口腔微生物組與疾病[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，41（1）：118-122.

[12]? Velculescu VE，Zhang L，Vogelstein B，et al. Serial analysis of gene expression [J]. Science，1995，270（5235）：484-487.

[13]? 張素琴，劉峰.宏基因組學(xué)在口腔微生物組研究中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2017，30（15）：2218-2220.

[14]? 馬潞林，宋一萌，葛力源.基因測序技術(shù)的發(fā)展與臨床應(yīng)用概述[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018，43（4）：7-9.

[15]? 王麗，吳亞菲，楊禾，等.不同采樣方法對齦下牙周致病菌檢出的研究[J].牙體牙髓病雜志，2009，19：234-238.

[16]? Maher CA，Kumarsinha C，Cao X，et al. Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer [J]. Nature，2009，458（7234）：97-101.

[17]? Logan G，F(xiàn)reimanis GL，King DJ，et al. A universal protocol to generate consensus level genome sequences for foot-and-mouth disease virus and other positive-sense polyadenylated RNA viruses using the Illumina MiSeq [J]. BMC Genomics，2014，15（1）：828.

[18]? Ullmann LS，de Camargo TC，Malossi CD，et al. Comparative clinical sample preparation of DNA and RNA viral nucleic acids for a commercial deep sequencing system （Illumina MiSeq？） [J]. J Virol Methods，2015，220：60-63.

[19]? 黃輝，陳冬娜，吳靜，等.高通量測序技術(shù)在罕見病分子診療中的應(yīng)用及臨床實例分析[J].藥學(xué)進(jìn)展，2016（6）：420-428.

[20]? Marquez IC，Rowland E，Andrian E，et al. Immune response and alveolar bone resorption in a mouse model of Treponema denticola infection [J]. Infect Immun，2009， 77（2）：694-698.

[21]? Cantarel BL，Coutinho PM，Rancurel C，et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database （CAZy）：an expert resource for Glycogenomics [J]. Nucleic Acids Res，2009， 37（suppl1）：D233-D238.

[22]? Galperin MY，Kristensen DM，Makarova KS，et al. Microbial genome analysis：the COG approach [J]. Briefings Bioinf，2017.