淺談不同甲酯化條件對牛乳中EPA、DHA含量測定影響

張加永 魏勝記 紀小蘭

摘 要： DHA和EPA對人體有重要的生理功能。它能調節(jié)人體的脂質代謝，治療和預防心腦血管疾病，促進生長發(fā)育。實驗部分采用氣相色譜法針對不同甲酯化條件下對牛乳中DHA和EPA進行測定研究，對甲酯化反應的時間、溫度、KOH-甲醇溶液加入量和濃度設計正交試驗，研究不同條件對牛乳中DHA和EPA測定的影響，最終確定甲酯化最佳條件，影響其甲酯化的因素依次為加入量>濃度>時間>溫度。

關鍵詞：DHA;甲酯化;氣相色譜

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子分析天平（AL204，梅特勒）;氣相色譜儀（GC-450，德國布魯克）渦旋混合儀（IKA）旋轉蒸發(fā)器（IKA）恒溫水浴鍋（上海一恒）

氨水（AR，天津福晨）;無水乙醇（AR，天津福晨）;乙醚氫氧化鉀-甲醇（AR，天津福晨）;正己烷（HPLC，天津福晨）;石油醚（AR，天津福晨）;無水硫酸鈉（AR，天津福晨）;EPA脂肪酸甲酯（上海安譜）;DHA脂肪酸甲酯（上海安譜）

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件

a） 毛細管柱：SP-2560或具有同等性能的柱子;b） 進樣口溫度，250℃;c） 分流比：20：1;進樣量：1μl;d） 檢測器溫度：300℃;

d） 程序升溫：初始溫度為80℃;14℃/min升至175℃保持5min。然后以4℃/min升至210℃保持2min;再以2℃/min升至230℃;

1.2.2方法原理

利用氨—乙醇溶液破壞乳的膠體性狀及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨—乙醇溶液中，再用乙醚—石油醚提取出脂肪。脂肪在室溫下在正己烷中與甲醇-氫氧化鉀反應快速酯化后進行氣相色譜柱分析，氫火焰離子化檢測器檢測，以外標法定量。

1.2.3待測樣品溶液的制備

準確稱量10g于平底燒瓶，加2ml氨水輕搖，于65℃水浴回餾15分鐘后，用10ml乙醇沖洗回餾管，冷卻至室溫。將樣品加入250ml分液漏斗中。用25ml乙醚沖洗燒瓶后加入分液漏斗中，再用50ml石油醚分兩次洗滌燒瓶后合并洗液，充分振搖。靜置分層后，分離出水相再用5ml無水乙醇、15ml乙醚 、15ml石油醚重復提取。合并有機相后，用純水洗滌有機相至中性，將有機相過無水硫酸鈉，除去少量的殘留水。在氮氣保護下將樣品濃縮近干。用正己烷沖洗濃縮瓶，定容至10ml，準確量取2ml提取液，加0.5ml無水甲醇—氫氧化鉀充分振搖，靜置酯化10分鐘后，取上清液，過濾，進樣。

2實驗結果與討論

2.1甲酯化最佳條件的確定

2.1.1 氫氧化鉀‐甲醇溶液濃度的確定

選擇濃度為1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L幾個濃度點經過水解、提取、濃縮、甲酯化、定容，取2ml提取液，分別加0.5ml上述濃度氫氧化鉀‐甲醇溶液，甲酯化10min后取上清液，過濾，經氣相檢測DHA、EPA含量當氫氧化鉀-甲醇濃度到達4mol/L時，含量基本上趨于穩(wěn)定，因此選擇氫氧化鉀-甲醇濃度為4mol/L。

2.1.2 氫氧化鉀‐甲醇溶液加入量的確定

樣品經處理后，分別加入4mol/L氫氧化鉀‐甲醇溶液0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml經振揺靜置10min后取上清液，過濾，經氣相檢測DH、EPA含量前階段隨DHA、EPA隨著氫氧化鉀-甲醇溶液加入量的增加而增加，當達到0.5ml時達到最大值，表明甲酯化進行完全，因此選用加入量為0.5ml。

2.1.3 甲酯化反應時間的確定

反應時間的長短直接決定甲酯化是否完全進行。經處理后的試樣加入0.5ml的4mol/L氫氧化鉀‐甲醇溶液振揺后分別靜置6min、8min、10min、12min、14min后取上清液，過濾，經氣相檢測DHA、EPA可以看出實驗靜置時間對反應的影響較小，在反應進行10min已經基本上趨于穩(wěn)定，因此選用反應時間為10min，當然在實際操作中可以適當延長一下。

2.1.4 甲酯化反應溫度的確定

經處理后的試樣分別加入0.5ml的4mol/L氫氧化鉀‐甲醇溶液振揺后分別在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃靜置10min后取上清液，過濾，經氣相檢測DHA、EPA含量不難看出在一般的室溫條件下都不會對結果造成太大的影響，滿足實驗室的分析要求。

2.2 正交試驗的結果與分析

設計正交試驗L9（34），研究脂肪被提取后與氫氧化鉀-甲醇溶液發(fā)生甲酯化反應，考察氫氧化鉀-甲醇濃度、加入量、反應時間、溫度、對實驗結果的影響，因看出四個因素對甲酯化的影響都不太顯著。因素水平中最佳工藝條件為：氫氧化鉀-甲醇濃度為4mol/L或5mol/L，加入量為0.5ml或0.6ml，溫度20℃或25℃，時間為10min或12min，從試劑節(jié)約、快速分析及柱子的使用壽命等角度考慮選前者為最佳組合。

2.3 實驗結果與結論

2.3.1實驗結果

采用本檢測方法，在原料中添加三個濃度水平（加標水平為0.2μg/mL、0.4μg/mL、4.0μg/mL）的兩種混合標準物質（DHA;EPA）進行加標回收實驗，結果樣品的加標回收率在83.0-115.6%的范圍內，在75%-125%回收率范圍內，可以對樣品進行定性定量處理。

2.3.2實驗結論

（1）室溫對甲酯化的影響不大，對實驗的結果幾乎沒有影響，化驗室的溫度完全滿足實驗的需要，氫氧化鉀-甲醇的濃度、加入量及靜置時間對實驗結果都有不同程度的影響，通過正交試驗對四個因素分析影響的主次順序為：加入量>濃度>時間>溫度。

（2）通過對甲酯化條件單因素變量分析最終確定最佳反應條件為氫氧化鉀-甲醇濃度為4mol/L，加入量為0.5ml，反應時間為10min，溫度為20℃。

（3）通過加標驗證，回收率比較高同時也說明此方法可行，滿足實驗室日常分析要求。

參考文獻

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