黃坤，陳冉，范小龍，劉迪，王會(huì)霞

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，武漢 430075）

0 引 言

三聚氰胺（melamine）是一種三嗪類含氮雜環(huán)的有機(jī)化合物，廣泛應(yīng)用于裝飾、制造和紡織等行業(yè)[1]。由于其含氮量高達(dá)66%，因此常被不法商家添加于飼料和奶制品用來提高蛋白質(zhì)含量，以次充優(yōu)[2]。2007-2008年國內(nèi)外相繼發(fā)生了三聚氰胺事件，相關(guān)行業(yè)遭遇了嚴(yán)重的信任危機(jī)，造成了惡劣的社會(huì)影響［3-4］。研究表明，食品包裝材料以及相關(guān)涂層中存在的三聚氰胺可能發(fā)生遷移而進(jìn)入食品中[5]，從而影響人體健康。含乳飲料由于具有豐富的營養(yǎng)成分而受到人們的廣泛喜愛，因此檢測其中三聚氰胺的殘留對(duì)于防范含乳制品污染意義重大。

目前三聚氰胺的測定方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》和文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]和高效毛細(xì)管電泳法[10]等，但普遍存在著基質(zhì)干擾嚴(yán)重、特異性較差、固相萃取耗時(shí)、處理過程繁瑣等問題。針對(duì)以上問題，本研究建立了一種快速測定含乳飲料中三聚氰胺殘留的同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法簡單快捷、回收率高，適用于含乳飲料的安全監(jiān)測與質(zhì)量控制。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Triple Quad 4500），美國SCIEX公 司；電子天平（ME2002E、XS204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；快速離心濃縮儀（EZ-2），英國GeneVac公司；離心機(jī)（Allegra X-15R），美國貝克曼庫爾特有限公司；全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)（Preval SPE 6S），北京普立泰科儀器有限公司；渦旋混合器（Talboys），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Generik DBX固相萃取柱（60 mg,3 mL），美國Sepax Technologies公司。

三聚氰胺（純度99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；穩(wěn)定同位素標(biāo)記物15N3-三聚氰胺（100 g/mL），美國Achemtek公司；乙腈、甲酸、乙酸銨、氨水（色譜級(jí)），美國Thermo Fisher Scientific公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；含乳飲料，來自本實(shí)驗(yàn)室日常抽檢所用試驗(yàn)樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

準(zhǔn)確稱取適量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈-水溶液（1+1）超聲溶解配制成100 g/mL左右的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；移取上述儲(chǔ)備溶液1 mL用乙腈稀釋至100 mL，即得1 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取穩(wěn)定同位素標(biāo)記物15N3-三聚氰胺0.5 mL，用乙腈稀釋至100 mL，即得0.5 g/mL的內(nèi)標(biāo)中間儲(chǔ)備溶液。

分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液20、50、100、200、500、1000、2000μL和200μL內(nèi)標(biāo)中間儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，加入初始比例的流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，即得內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品的提取與凈化

稱取已混勻的含乳飲料試樣1g于15 mL離心管中，加入10μL的內(nèi)標(biāo)中間儲(chǔ)備溶液，再加入5 mL乙腈，渦旋分散后超聲提取5 min，以4 000 r/min離心5 min。取全部上清液過Generik DBX固相萃取柱（使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化），控制流速不超過1滴/s，依次用水和甲醇淋洗，氨化乙腈溶液（5+95）洗脫，洗脫液于50℃條件下快速離心濃縮至干，加入初始比例流動(dòng)相0.5 mL渦旋復(fù)溶，過0.22μm微孔濾膜，續(xù)濾液待分析。

1.4 液相及質(zhì)譜條件

1.4.1 液相條件

超高效液相色譜儀，ExionLC；色譜柱，MN Nucleoshell Hilic色譜柱(100 mm×3 mm，2.7μm)；柱溫35℃，樣品池溫度15℃，流動(dòng)相A：0.005 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（50+50），流動(dòng)相B：0.1%甲酸水溶液-乙腈（5+95），流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2μL，梯度洗脫條件見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀選擇電噴霧離子源，正離子模式，優(yōu)化后相關(guān)條件如下：電噴霧電壓(IS)為5 500 V，碰撞氣壓力(CAD)9 Psi，霧化氣壓力(GS1)50 Psi，氣簾氣壓力(CUR)35 Psi，輔助氣壓力(GS2)50 Psi，離子源溫度(TEM)500℃。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下三聚氰胺和15N3-三聚氰胺基質(zhì)加標(biāo)溶液（三聚氰胺：50 ng/mL，15N3-三聚氰胺：10 ng/mL）的子離子流圖如圖1所示。

表1 梯度洗脫程序

圖1 三聚氰胺和15N3-三聚氰胺基質(zhì)加標(biāo)溶液的子離子流圖

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜參數(shù)的選擇

2.1.1 色譜參數(shù)的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-水、乙腈-乙酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液和甲酸-乙酸銨-乙腈混合體系作為流動(dòng)相進(jìn)行三聚氰胺的測定。結(jié)果表明乙腈-水和乙腈-甲酸水溶液流動(dòng)相體系峰型較寬、拖尾嚴(yán)重，乙腈-乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)保留時(shí)間容易漂移，而甲酸-乙酸銨-乙腈混合體系（A：0.005 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（50+50），流動(dòng)相B：0.1%甲酸水溶液-乙腈（5+95））進(jìn)行梯度洗脫時(shí)三聚氰胺峰型尖銳且對(duì)稱、保留時(shí)間適宜且穩(wěn)定。綜合分離效果、響應(yīng)強(qiáng)度、測定時(shí)間以及系統(tǒng)穩(wěn)定性考慮，最終選擇甲酸-乙酸銨-乙腈混合體系作為流動(dòng)相進(jìn)行分離。

同時(shí)考察了MN Nucleoshell Hilic和Waters XBridge Amide兩種類型的色譜柱在甲酸-乙酸銨-乙腈混合體系流動(dòng)相洗脫下的分離效果。試驗(yàn)表明，三聚氰胺在兩根色譜柱上的分離存在一定差異，使用后者目標(biāo)峰存在拖尾現(xiàn)象且保留時(shí)間發(fā)生漂移不夠穩(wěn)定，因此選用MN Nucleoshell Hilic色譜柱作為實(shí)驗(yàn)用柱。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

以10μL/min的流速分別注入200 ng/mL左右的三聚氰胺和15N3-三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定較為合適的母離子掃描條件，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描，篩選信號(hào)最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子，信號(hào)次強(qiáng)的離子對(duì)作為定性離子對(duì)，通過優(yōu)化溫度、電壓和氣壓等參數(shù)得到多反應(yīng)監(jiān)測條件（MRM）：定量及定性離子對(duì)、去簇電壓和碰撞電壓，詳見表2。

表2 三聚氰胺和15N3-三聚氰胺的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

目前含乳制品中三聚氰胺的殘留檢測主要依據(jù)現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388-2008，該法采用三氯乙酸溶液和乙腈提取，外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)過程表明，對(duì)于奶粉樣品該法處理較為適宜，而對(duì)于液態(tài)含乳制品存在明顯不足，提取過程常常由于溶液難以沉淀、基質(zhì)干擾等問題導(dǎo)致固相萃取過程耗時(shí)和回收率偏低。針對(duì)含乳飲料的液態(tài)產(chǎn)品特性，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取液進(jìn)行提取目標(biāo)物并沉淀蛋白，無需高速離心和濾紙過濾即可得到澄清的待凈化液，大大縮短了后續(xù)固相萃取凈化的流程，提高了實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)向樣品中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記物15N3-三聚氰胺同法處理，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算定量，可以有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，補(bǔ)償由基質(zhì)抑制導(dǎo)致的測定偏差。

本實(shí)驗(yàn)還比較了Generik DBX、Anpelclean MCT、Oasis MCX三種不同品牌固相萃取柱的凈化效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Oasis MCX柱通過速率略低于其他兩種，而回收率方面Generik DBX柱保持在80%以上優(yōu)于其他兩種，因此選擇Generik DBX固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

按照1.2項(xiàng)下的處理得到濃度分別為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.4和2.1項(xiàng)下所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值Cx/C0對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積的比值A(chǔ)x/A0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=0.3867X-0.3384，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，表明三聚氰胺濃度在2～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以空白含乳飲料作為基質(zhì)，加入一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法和條件分析，以S/N=10結(jié)合噪音響應(yīng)情況確定方法的定量限（LOQ）為2μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

為了驗(yàn)證本方法測定含乳飲料中三聚氰胺殘留的可行性和準(zhǔn)確性，試驗(yàn)采用空白含乳飲料基質(zhì)（已檢測過的陰性樣品）進(jìn)行加標(biāo)回收率驗(yàn)證，加標(biāo)水平分別為10、25、50 g/kg，按照前述方法處理，每個(gè)水平重復(fù)6次試驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，回收率為82.37%～103.15%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜6%，方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性符合實(shí)驗(yàn)室測定需求。

表3 含乳飲料中三聚氰胺的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 實(shí)際樣品測試

按本文所建立的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)督抽檢的一批80份含乳飲料樣品中三聚氰胺殘留進(jìn)行了檢測，結(jié)果測得其中2份含量分別為3.2μg/kg和2.5μg/kg，其余樣品均為未檢出，說明含乳飲料中三聚氰胺殘留尚在安全可控范圍，符合衛(wèi)生部公告（2011年第10號(hào)）的要求（限量值為2.5 mg/kg）。同時(shí)將該方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室奶粉考核樣品（編號(hào)FAPAS TEST 3086），樣品溶解后同法處理，測得其中三聚氰胺含量為1.399 mg/kg，與指定值1.420 mg/kg十分接近，表明該方法也同樣適用于奶粉樣品中三聚氰胺含量的測定。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，有效解決了含乳飲料中三聚氰胺殘留測定過程中固相萃取柱堵塞與復(fù)雜基質(zhì)干擾等問題，與常規(guī)方法相比分析過程簡單快捷、回收率好、靈敏度高，適合含乳飲料及相關(guān)含乳制品中三聚氰胺殘留的快速檢測。