★ 吳娜 毛祥坤 許嵩 (.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；.南昌市洪都中醫(yī)院 南昌 330006)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝臟損害因素所致的，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗及遺產(chǎn)易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝病[1]。研究顯示，歐美國家普通成年人NAFLD發(fā)病率為20%～33%，而在中國，NAFLD現(xiàn)已取代病毒性肝炎成為第一大慢性肝病，且發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢[2-4]。雖早期單純性脂肪肝積極治療可完全恢復(fù)，但仍有約20%的患者可進(jìn)展為肝硬化和終末期肝病，嚴(yán)重危害人們的身體健康[5]。NAFLD發(fā)生發(fā)展的生物過程極其復(fù)雜，目前并不十分清楚，研究NAFLD的分子作用機(jī)制對于其診斷、治療及預(yù)后至關(guān)重要。隨著科技的進(jìn)步，微陣列和高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析及靶點的預(yù)測，有助于制定新的診斷和治療策略。

1 研究方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲得 在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm)中搜索從2010年1月1日―2018年12月1日的所有數(shù)據(jù)，使用以下關(guān)鍵詞進(jìn)行基因表達(dá)譜篩選：①非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)；②組織來源為“人肝臟組織”；③研究類型為“數(shù)組表達(dá)式分析(Expression profiling by array)”；④實驗組為非酒精性脂肪肝，對照組為健康人肝臟；⑤樣本量超過40且實驗組樣本量不低于20。最終篩選出表達(dá)譜GSE89632，其中實驗組有20個肝組織樣本，對照組有24個樣本。

1.2 數(shù)據(jù)的處理 GEO2R (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO數(shù)據(jù)庫提供的一個基于R語言的在線分析程序，可用于比較兩組數(shù)據(jù)[6]。使用GEO2R對實驗組及對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，且以調(diào)整P<0.01和|logFC|≥1.5為基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終得出差異基因(differentially expressed genes, DEGs)。

1.3 差異基因Gene Ontology(GO)分析及通路富集分析 DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)是一套完整的功能注釋在線工具，供研究者理解大量基因背后的生物學(xué)意義[7]。將篩選出的DEGs輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO及 KEGG分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析 STRING(The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)是一個搜尋蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的在線軟件，其旨在提供蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的評估和集成，它們之間的相互作用包括了直接的(物理)和間接的(功能)關(guān)聯(lián)[8]。將DEGs輸入String數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白-蛋白互作分析，選取蛋白-蛋白互作得分大于0.4的基因輸入Cytoscape軟件(3.2.1)進(jìn)行可視化分析。用分子復(fù)合物檢測算法(Molecular Complex Detection, MCODE)[9]進(jìn)行模塊分析，以degree cut-off為10, haircut on, node score cut-off為0.2, k-core為2, 及max depth為100篩選重要模塊。用Cytohubba軟件對差異基因以度(degree)來進(jìn)行計算，所得前10個基因為關(guān)鍵基因，將10個關(guān)鍵基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫再一次進(jìn)行KEGG pathway富集分析。

2 結(jié)果

2.1 所得差異基因 經(jīng)過篩選后GSE89632基因芯片數(shù)據(jù)中符合條件的差異基因有124個，其中21個下調(diào)DEGs,103個上調(diào)DEGs。

2.2 DEGs的GO分析及KEGG pathway富集結(jié)果 運用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對21個下調(diào)基因及103個上調(diào)基因進(jìn)行GO和KEGG pathway富集，最終得出：下調(diào)DEGs的GO分析可見其生物過程(biological process, BP)主要集中在碳水化合物體內(nèi)平衡、維持葡萄糖的穩(wěn)態(tài)、尿素的代謝、細(xì)胞酰胺代謝過程、氮循環(huán)代謝過程等幾個方面，細(xì)胞組成(cellular component，CC)主要集中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分，分子功能(Molecular Function，MF)主要表現(xiàn)在G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、卷曲蛋白的結(jié)合；由于基因較少，未富集到KEGG pathway，詳見表1。103個上調(diào)基因GO分析可見其BP主要集中對外部刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控、對血管的作用等部分，CC主要集中在細(xì)胞外、胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)等幾部分，MF主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域序列特異性結(jié)合、受體的結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合等；其KEGG pathway富集發(fā)現(xiàn)TNF信號通路、破骨細(xì)胞的分化、JAK/STAT信號通路等，詳見表2。

表1 21個下調(diào)DEGs中GO分析結(jié)果

注：Count:每行基因富集的數(shù)目；若一個類別中有超過5項的富集項，則根據(jù)P值選擇前5。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及重要模塊的分析 將124個DEGs輸入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，總共有122個節(jié)點，92條邊，平均每個節(jié)點的度為5.92，平均局部聚類系數(shù)為0.444。將蛋白-蛋白互作得分大于0.4的基因輸入Cytoscape軟件(3.2.1)進(jìn)行可視化分析，可見網(wǎng)絡(luò)圖中的棱形節(jié)點代表上調(diào)的DEGs，圓形節(jié)點代表下調(diào)的DEGs，邊(Edge)代表蛋白與蛋白間的相互作用。應(yīng)用軟件中的Network Analysis plugin 對構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行統(tǒng)計，分析節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)圖中的作用，其中節(jié)點(Node)的顏色根據(jù)其在網(wǎng)絡(luò)中自由度(Degree)的大小來進(jìn)行渲染，顏色由黃色逐漸漸變成紅色，紅色越深，該節(jié)點的自由度越大，在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能則越多，詳見圖1。用Ctyohubba插件計算最終得出10個關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)10個DEGs均為過表達(dá)基因,具體如下：Transcription factor AP-1(JUN)、Interleukin-6(IL6)、Proto-oncogene c-Fos(FOS)、Myc proto-oncogene protein(MYC)、C-C motif chemokine 2(CCL2)、Interleukin-8(IL8)、Interleukin-1 beta(IL1B)、Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-3(ATF3)、Early growth response protein 1(EGR1)、Plasminogen activator inhibitor 1(SERPINE1)，詳見圖2。用MCODE插件對其中重要的模塊分析后發(fā)現(xiàn)該模塊分?jǐn)?shù)為6.571，節(jié)點有15個，邊有46條，詳見圖3。將10個關(guān)鍵基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫中再次進(jìn)行KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)其亦是與TNF信號通路密切相關(guān)，詳見圖4。

表2 103個上調(diào)DEGs中GO分析及KEGG pathway富集結(jié)果

注：Count:每行基因富集的數(shù)目；若一個類別中有超過5項的富集項，則根據(jù)P值選擇前5。

圖1 DEGs蛋白-蛋白相互作用圖

3 討論

本文對GSE89632芯片數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝患者與健康人相比，有124個差異基因(21個下調(diào)DEGs及103個上調(diào)DEGs),通過計算發(fā)現(xiàn)JUN、IL6、FOS、MYC、CCL2、IL8、IL1B、ATF3、EGR1、SERPINE1為潛在的關(guān)鍵基因，且在NAFLD中均為過表達(dá)基因。其中IL6、IL8、IL1B均屬于白介素家族，為炎癥因子，而炎癥反應(yīng)在整個NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程產(chǎn)生著重要的影響，也是其主要特征之一[10]。多項研究表明[11-13]，在脂肪肝組織中，IL6、IL8等炎癥因子常為過表達(dá)狀態(tài)。CCL2為趨化因子，為多功能介質(zhì)，主要負(fù)責(zé)炎癥組織白細(xì)胞的募集，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[14]。ERG1、JUN、FOS、MYC均屬于即刻早期基因家族，是細(xì)胞增殖、分化的重要介質(zhì)，其與炎癥反應(yīng)、腫瘤密切相關(guān)[15]。有研究指出[16]，ERG1在脂肪肝組織中過表達(dá)，可誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，參與肝組織損傷、肝細(xì)胞癌癥等過程。而JUN、FOS、MYC等常在肝癌組織中過表達(dá)，與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[17-18]。ATF3為肝臟活化轉(zhuǎn)錄因子3，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，有研究發(fā)現(xiàn)，它在脂肪肝中過表達(dá)，認(rèn)為它可能在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝臟脂肪變性和2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而體內(nèi)ATF3沉默可能是預(yù)防NAFLD的潛在重要靶點[19]。SERPINE1基因與癌癥相關(guān)，常在癌組織中過表達(dá)[20-21]。通過KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路可能是NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。TNF-α為腫瘤壞死因子，是炎癥介質(zhì)的一種，在肝臟受損時，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起肝細(xì)胞變性壞死及纖維組織增生，同時，常與IL6等相協(xié)同，幫助枯否細(xì)胞的募集、激活及參與肝臟胰島素抵抗，在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,而TNF信號通路亦與脂肪肝密切相關(guān)[22-25]。

圖2 前10個靶基因蛋白相互作用圖

圖3 MCODE中重要模塊

圖4 前10靶基因KEGG Pathway富集圖

綜上所述，通過對GEO數(shù)據(jù)庫中GSE89632進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵基因可能為JUN、IL6、FOS、MYC、CCL2、IL8、IL1B、ATF3、EGR1、SERPINE1，重要的信號通路可能為TNF信號通路。