★ 金桂林 楊軍平 許忠波 楊小軍 梁華 白高波 (. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn) 南昌 330006；. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院急診科 南昌 330006)

目前，隨著臨床插管、心臟支架、人工關(guān)節(jié)等醫(yī)療器材的廣泛使用，因此而帶來(lái)的細(xì)菌生物被膜感染也越來(lái)越多。然而，生物被膜的抵抗作用使抗生素難以殺死膜內(nèi)細(xì)菌，治療此類感染需要大劑量的抗生素，從而極易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性，為臨床治療帶來(lái)困難。最終，臨床治療時(shí)只能通過(guò)更換留置物來(lái)徹底解決此類困惑，以至于給患者造成巨大的身心創(chuàng)傷及高昂的醫(yī)療費(fèi)用。為此，本研究以表皮葡萄球菌生物被膜模型為研究對(duì)象，采用試管二倍稀釋法，進(jìn)行體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)，觀察大蒜素聯(lián)用后在抑制生物被膜生長(zhǎng)及其相關(guān)基因icaA表達(dá)的變化，研究中藥的抑菌作用，探討降低臨床細(xì)菌耐藥率的新途徑。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)外科住院患者傷口分泌物中分離得來(lái)。

1.2 主要試劑及儀器 大蒜素注射液(江蘇正大天晴)；鹽酸環(huán)丙沙星注射液(廣東環(huán)球制藥)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州天和)；普通細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀器WalkAway-96(SIEMENS，Germany)、二氧化碳細(xì)菌培養(yǎng)箱(SANYO，JAPAN)、酶標(biāo)儀(北京普朗)、QT-PCR儀(ABI，美國(guó))、生物安全柜(AIRTECH蘇凈安泰，中國(guó))。

2 方法

2.1 制備菌液 制備0.5麥?zhǔn)隙?1.5×108CFU/mL)的細(xì)菌菌液，再稀釋15倍，將濃度調(diào)為1.0×107CFU/mL， 于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試管二倍稀釋法 將抗菌藥進(jìn)行梯度二倍稀釋后接種檢測(cè)菌，37℃孵育24h后，將肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生物被膜孔的最低藥物濃度定為藥物的最低抑菌濃度。分五組進(jìn)行：A大蒜素組，準(zhǔn)備10支無(wú)菌試管,加入大蒜素,從濃度900μg /mL開(kāi)始對(duì)倍稀釋，后分別加50μL表皮葡萄球菌菌液,使終液濃度為5×105 CFU/mL；B環(huán)丙沙星組，準(zhǔn)備10支無(wú)菌試管,加環(huán)丙沙星,從濃度100μg /mL開(kāi)始對(duì)倍稀釋，后分別加50μL表皮葡萄球菌菌液,使終濃度約為5×105CFU/mL；C大蒜素+環(huán)丙沙星組，取10支試管,加入大蒜素，從濃度900μg /mL開(kāi)始對(duì)倍稀釋，后分別加50μL 表皮葡萄球菌菌液，使終濃度為5×105CFU/mL，37℃培養(yǎng)6h后,加入環(huán)丙沙星，使1～10試管濃度為100～0.195μg /mL 10個(gè)梯度； D陰性對(duì)照組只加肉湯；E陽(yáng)性對(duì)照組只加肉湯及菌液；37℃培養(yǎng)24h后,觀察記錄各組MIC值。

2.3 藥物抑制細(xì)菌被膜的觀察 分A環(huán)丙沙星組、B大蒜素+環(huán)丙沙星組；取96孔板，每孔總量200μL，菌液終濃度5×105CFU/mL，37℃孵箱培養(yǎng)24h后，加入藥物組，其濃度按1.3.2所得的 MIC進(jìn)行，繼續(xù)培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，取相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)孔進(jìn)行結(jié)晶紫染色，于595nm處測(cè)各自O(shè)D值。

2.4 藥物處理后，QT-PCR檢測(cè)基因icaA、agr的表達(dá) 分A環(huán)丙沙星組、B大蒜素+環(huán)丙沙星組；每孔總量200μL，菌液終濃度5×105CFU/mL，37℃孵箱培養(yǎng)24h后，加入藥物組，其濃度按"1.3.2"項(xiàng)下所得的 MIC進(jìn)行，繼續(xù)培養(yǎng)48h后超聲震蕩取菌，利用QT-PCR檢測(cè)生物被膜相關(guān)基因icaA的表達(dá)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)軟件，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料，用均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差描述，根據(jù)設(shè)計(jì)類型采用相應(yīng)的t檢驗(yàn)；如不符合用四分位數(shù)和中位數(shù)描述，根據(jù)設(shè)計(jì)類型采用相應(yīng)秩和檢驗(yàn)，P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大蒜素、環(huán)丙沙星單用及聯(lián)用MIC(試管二倍稀釋法) 單用抑制表皮葡萄球菌被膜時(shí)，MIC大蒜素為(28.125±3.12)μg /mL， MIC環(huán)丙沙星為(3.125±0.23)μg /mL；兩者聯(lián)用時(shí)，MIC大蒜素、MIC環(huán)丙沙星分別為(14.063±2.30)μg /mL、(1.563±0.09)μg /mL，兩數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析后發(fā)現(xiàn)聯(lián)用前后MIC有顯著差異(P<0.05)，且明顯降低。

表1 兩藥物單用及聯(lián)用MIC值

圖1 兩藥物單用及聯(lián)用后MIC值(P<0.05)

3.2 藥物抑制細(xì)菌被膜的觀察 在兩組藥物抑制細(xì)菌被膜在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h時(shí)間點(diǎn)結(jié)晶紫染色后，于595nm處測(cè)定OD值。圖2顯示，兩組均可一定程度地抑制表皮葡萄球菌被膜的生長(zhǎng)，而且隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)，加了大蒜素的藥物組抑制作用更加明顯，特別是在36h后，影響效果出現(xiàn)了大幅度的增強(qiáng)。

圖2 兩組藥物抑制細(xì)菌被膜的生長(zhǎng)曲線

3.3 藥物處理后，QT-PCR檢測(cè)基因icaA的表達(dá) 兩組藥物抑制細(xì)菌被膜在48h后超聲震蕩取菌，利用QT-PCR檢測(cè)生物被膜相關(guān)基因icaA的表達(dá)量變化。表2結(jié)果顯示， 兩組藥物抑制后，icaA的表達(dá)存在變化；大蒜素+環(huán)丙沙星組抑制后，icaA的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

表2 兩組藥物抑制后icaA的表達(dá)變化

圖3 兩組藥物抑制后icaA的表達(dá)變化(P<0.05)

4 討論

當(dāng)今，隨著臨床插管、心臟支架、人工關(guān)節(jié)等醫(yī)療器械的廣泛使用[1]，由此帶來(lái)的細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm, BBF)的感染也越來(lái)越多[2]。BBF是指細(xì)菌附于惰性材料后,繁殖、分化,并分泌多糖基質(zhì)將菌體包裹于其中克隆聚集纏繞形成的細(xì)菌聚集體膜狀物[3]，它通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞間脂多糖，保護(hù)細(xì)菌不受抗菌藥物的抑制，從而逃避機(jī)體免疫，成為潛在感染源,最終引發(fā)感染的反復(fù)發(fā)作且難以控制[4-5]。由此，BBF的抵抗作用使抗菌藥物難以到達(dá)膜內(nèi)殺死細(xì)菌，導(dǎo)致臨床治療需要大劑量抗生素，從而容易引起細(xì)菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性[6]，為治療帶來(lái)嚴(yán)重的困難[5]。最終，臨床上對(duì)此不得不更換留置物來(lái)徹底解決此類問(wèn)題，給患者帶來(lái)身心劇痛及高昂的醫(yī)療費(fèi)用。目前，表皮葡萄球菌是臨床常見(jiàn)致病菌[7]，也是引起B(yǎng)BF的常見(jiàn)細(xì)菌，表皮葡萄球菌生物被膜形成而導(dǎo)致的各系統(tǒng)感染已成為臨床感染難治性的重要類型之一[8]。因此，探索新途徑治療細(xì)菌生物被膜感染具有十分重要的臨床醫(yī)學(xué)意義[9-10]。

現(xiàn)代藥理研究表明，中藥應(yīng)用后具有不良反應(yīng)低、不易產(chǎn)生耐藥性以及與抗生素聯(lián)用可減少細(xì)菌耐藥性等優(yōu)勢(shì)，對(duì)解決臨床耐藥菌株的產(chǎn)生及抗生素短缺有著及其重要意義[11-12]。早在3000 多年前，在《本草綱目》中就有關(guān)大蒜藥用價(jià)值的記載，中醫(yī)認(rèn)為，大蒜性味辛、溫，功效為行滯氣、消癥積、暖脾胃、解毒。而大蒜素是就是從大蒜球莖中分離出的有效成分，為三硫代烯丙醚類化合物，1944 年由 Chester J.Cavallito 首次分離提純。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，大蒜素在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，除了具有良好的降壓、降脂、抗腫瘤活性作用外，還具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，對(duì)多種球菌、桿菌、真菌、病毒等均有抑制或殺滅作用。2012年，Young-Sun Kim等[13]探討了大蒜素聯(lián)合真菌藥對(duì)真菌活性的影響，研究表明：大蒜素聯(lián)合兩性霉素B可大大降低白色念珠菌的活性，可極大地?fù)p傷真菌細(xì)胞的細(xì)胞膜，減少兩性霉素B的用量。2014年，Haohan Zhai等[14]研究者探討大蒜素是否可在在體內(nèi)可抑制細(xì)菌黏附繼而阻止細(xì)菌生物膜的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素不僅可以抑制細(xì)菌生物膜的形成，還可以增強(qiáng)萬(wàn)古霉素的抗菌功能，并指出兩者的聯(lián)合也許可以作為治療假肢性關(guān)節(jié)炎的有效手段。2015年，Bárbara Pérez-K hler等[15]以小白鼠作為研究模型，發(fā)現(xiàn)用大蒜素、洗必泰抗菌效果明顯，用其預(yù)先處理過(guò)的聚丙烯網(wǎng)在疝修補(bǔ)術(shù)的中可加速組織的收縮，加快傷口的愈合。由此可見(jiàn)，大蒜素已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，可極大提高臨床抗菌療效，有良好的臨床應(yīng)用前景。所以對(duì)大蒜素更多的生理功效進(jìn)行深層的探索是有價(jià)值的。

本研究表明，大蒜素、環(huán)丙沙星單用抑制表皮葡萄球菌被膜時(shí)，MIC大蒜素為(28.125±3.12)μg /mL， MIC環(huán)丙沙星為(3.125±0.23)μg /mL；兩者聯(lián)用時(shí)，MIC大蒜素、MIC環(huán)丙沙星分別為(14.063±2.30)μg /mL、(1.563±0.09)μg /mL，兩數(shù)據(jù)有顯著差異(P<0.05)，且明顯降低(圖1)；與此同時(shí)，我們將環(huán)丙沙星組、大蒜素+環(huán)丙沙星組藥物作用后發(fā)現(xiàn)，加了大蒜素的藥物組抑制被膜生長(zhǎng)的作用更加明顯，特別是在36h后，影響效果出現(xiàn)了大幅度的增強(qiáng)(圖2)，而且表皮葡萄球菌被膜的相關(guān)基因icaA[16]的表達(dá)量也是顯著降低(表2)。上述結(jié)果表明，大蒜素對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜也具有一定的抑制作用，在今后的臨床細(xì)菌感染治療中，我們應(yīng)該考慮到中藥的有效應(yīng)用；另一方面，與環(huán)丙沙星聯(lián)用，可以有效減少環(huán)丙沙星的用量，降低抗生素的臨床劑量，這將為其它抑制細(xì)菌生物被膜的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的數(shù)據(jù)參考，也為臨床上研究如何減少抗生素的使用、降低細(xì)菌耐藥率提供了新的方向。

綜上所述，本研究以表皮葡萄球菌生物被膜為研究對(duì)象，闡述了大蒜素聯(lián)用后的良好效應(yīng)，一方面可為研究中藥對(duì)細(xì)菌生物被膜的抑制及臨床治療相關(guān)細(xì)菌生物被膜感染提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考，也將為中藥制劑在人體內(nèi)抑菌作用機(jī)制的研究及更深入地研發(fā)中藥的臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；另一方面，為臨床上研究如何降低細(xì)菌耐藥率提供了新的方向。