采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)鑒定連翹中45種化學(xué)成分

周明月 霍金海 孫國(guó)東 王偉明

中圖分類(lèi)號(hào) R282;R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）22-3067-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.09

摘 要 目的：對(duì)連翹藥材的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。方法：利用超高效液相色譜聯(lián)用四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)對(duì)連翹的化學(xué)成分進(jìn)行分析。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL;采用電噴霧正、負(fù)離子模式檢測(cè)，離子源溫度為550 ℃，霧化氣體為N2，霧化氣、輔助氣壓力均為379.2 kPa，氣簾氣壓力為241.3 kPa，去簇電壓為80 V/-80 V，碰撞能量為35 eV/-35 eV，質(zhì)量掃描范圍為80～1 500 Da。利用Peakview 2.0軟件通過(guò)所測(cè)得成分的一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行目標(biāo)性篩查，并計(jì)算各成分的高分辨精確分子量，對(duì)比對(duì)照品圖譜以及相關(guān)文獻(xiàn)，或計(jì)算二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子的元素組成及分析其裂解途徑，推斷化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果與結(jié)論：共鑒定出連翹中的45個(gè)化合物，包括7個(gè)苯乙醇苷類(lèi)成分、5個(gè)木脂素類(lèi)成分、5個(gè)萜類(lèi)成分、12個(gè)黃酮類(lèi)成分、7個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、2個(gè)酚類(lèi)成分、2個(gè)醌類(lèi)成分、2個(gè)苷類(lèi)成分和3個(gè)其他成分;其中有19個(gè)化合物為首次在連翹中得以鑒定。本研究可為連翹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究及其成分的快速定性、定量分析提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 連翹;化學(xué)成分;鑒定;超高效液相色譜;四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜;苯乙醇苷類(lèi);木脂素類(lèi)

Identification of 45 Kinds of Chemical Components of Forsythia suspensa by UPLC-Q-TOF-MS

ZHOU Mingyue，HUO Jinhai，SUN Guodong，WANG Weiming（Institute of Chinese Materia Medica， Heilongjiang Academy of TCM， Harbin 150036， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To identify chemical components of Forsythia suspense. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS technology was used for the chemical components analysis of F. suspense. The determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution （A）- 0.1% formic acid acetonitrile solution （B） with ?gradient elution， at the flow rate of 0.3 mL/min; the column temperature was set at 30 ℃; the sample size was 5 μL. Positive and negative ions were detected by electrospray ionization. The temperature of the ion source was 550 ℃; the atomizing gas was N2; the atomizing gas and the auxiliary pressure were 379.2 kPa; the air curtain pressure was 241.3 kPa; the decluster voltage was 80 V/-80 V; the collision energy was 35 eV/-35 eV; the mass scanning range was 80-1 500 Da. Peakview 2.0 software was used to screen the target components by the first-order mass spectrometry， and calculate the high-resolution and accurate molecular weight of each component， compare with the reference spectrum and related literature， or calculate the elemental composition of fragment ions in the second-order mass spectrometry， analyze their decomposition pathways， then infer the structure of compounds. RESULTS & CONCLUSIONS： 45 kinds of compounds were identified from F. suspense，which included 7 phenylethanol glycosides，5 lignans，5 terpenes， 12 flavonoids，7 organic acids，2 phenols，2 quinones，2 glycosides and 3 other components. There were 19 compounds identified for the first time in F. suspense. The study provides a reference for the in-depth study of the pharmacodynamic substance basis of F. suspense and the rapid qualitative and quantitative analysis of the components.

KEYWORDS ? Forsythia suspense; Chemical components; Identification; UPLC; Q-TOF-MS; Phenylethanol glycosides; Lignins

連翹為木犀科連翹屬植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實(shí)，氣微香，味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效，有“瘡家圣藥”之稱。連翹在臨床上常用于治療癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I(yíng)、高熱煩渴等癥[1]。現(xiàn)代藥理研究顯示，連翹具有抗炎、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、止嘔、保肝等作用，具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值[2]。然而，目前研究者對(duì)連翹化學(xué)成分的研究多集中于單個(gè)成分的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定[3-5]，檢測(cè)手段單一，在線分離與系統(tǒng)分析的報(bào)道較少，且所建立方法不能全面反映連翹藥材的組成，這限制了對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的全面認(rèn)識(shí)及多成分的快速定性定量分析，不利于該藥材資源的深入開(kāi)發(fā)與利用。隨著對(duì)連翹藥理作用研究的深入，其化學(xué)成分的全面快速鑒定成為亟待解決的問(wèn)題。

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)是當(dāng)代最重要的分離鑒定分析方法之一，兼具LC技術(shù)高分離效能和MS技術(shù)高靈敏度、高選擇性為一體的優(yōu)點(diǎn)。中藥材及中藥復(fù)方中化學(xué)成分種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，LC-MS已成為快速分析鑒定其化學(xué)成分最常用的有力工具[6-10]。近年來(lái)，超高效液相色譜聯(lián)用四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC- Q-TOF-MS）技術(shù)已廣泛用于中藥成分的在線分析與藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)研究中[11-13]。本課題組前期采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)連翹中最主要的化學(xué)成分——苯乙醇苷類(lèi)成分（具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，被認(rèn)為是連翹中的主要活性成分[14]）進(jìn)行了詳細(xì)解析?；诖?，本研究將采用此技術(shù)進(jìn)一步對(duì)連翹中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，以便闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC型UPLC儀（美國(guó)Waters公司）;AB Sciex Triple-TOFTM 5600型MS儀（美國(guó)Sciex公司）;KQ-300DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BSA224S-CW型電子天平、BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)分別為L(zhǎng)-012-171216、L010- 170301、L-007-160504，純度均≥98%）;蘆丁對(duì)照品（國(guó)家食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707，純度：≥98%）;甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）;乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）;甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）;蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 藥材

連翹藥材（青翹，采收時(shí)間為2018年6月，批號(hào)：180601）購(gòu)于北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院霍金海副研究員鑒定為木犀科連翹屬植物連翹[F. suspensa（Thunb.）Vahl]的果實(shí)。藥材粉碎后過(guò)三號(hào)篩，備用。

2 方法

2.1 LC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，5%B→25%B;3～13 min，25%B→80%B;13～23 min，80%B→100%B;23～23.1 min，100%B→5%B;23.1～25 min，5%B）;流速：0.3 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 MS條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）;離子化模式：電噴霧正、負(fù)離子模式;離子噴霧電壓（ESI+/ESI-）：5 500 V/-4 500 V;離子源溫度：550 ℃，去簇電壓：80 V/-80 V;碰撞能量：35 eV/-35 eV，碰撞活化掃描能量：15 eV;霧化氣體：N2;霧化氣、輔助氣壓力：379.2 kPa;氣簾氣壓力：241.3 kPa;質(zhì)量掃描范圍：80～1 500 Da。對(duì)響應(yīng)值超過(guò)100 cps的8個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子質(zhì)量掃描范圍為50～1 500 Da，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。采用Analyst TF 1.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用PeakView 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.3 供試品溶液的制備

取連翹細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：300 W，頻率：100 kHz）處理30 min;放冷后，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻;溶液以0.22 ?m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

取連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，分別制成質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.5 UPLC-MS分析

取“2.3”“2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.1” “2.2”項(xiàng)下LC與MS條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，用于后續(xù)成分篩查與結(jié)構(gòu)鑒定。

2.6 連翹化學(xué)成分解析

2.6.1 成分篩查 通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，將連翹屬化學(xué)成分信息進(jìn)行匯總，包括中文或英文名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式、相對(duì)分子質(zhì)量、成分類(lèi)型、化學(xué)物質(zhì)登錄號(hào)（CAS號(hào)）、所屬植物藥用部位、結(jié)構(gòu)鑒定信息（包括質(zhì)譜、氫譜、碳譜等），建立一個(gè)包含連翹屬157種化合物的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。選擇Peakview 2.0軟件中的“MasterView”工具，設(shè)置“Mass Error”值<5×10-6（權(quán)重為30%）、“Isotope”差異值<10%（權(quán)重為40%）、“Formula Finder Score”值>70%（權(quán)重為40%），通過(guò)所測(cè)得的成分的一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行目標(biāo)性篩查。

2.6.2 結(jié)構(gòu)鑒定 利用Peakview 2.0軟件中的“Formula Findera”工具計(jì)算各成分的高分辨精確分子質(zhì)量，快速推測(cè)各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的分子式，并與已有對(duì)照品的保留時(shí)間及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比，推斷成分結(jié)構(gòu);對(duì)于一些無(wú)法獲得對(duì)照品的化合物，先依據(jù)二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子信息計(jì)算出其元素組成，再推測(cè)其裂解方式，進(jìn)一步推斷出化合物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析結(jié)果

在正、負(fù)離子模式下，供試品溶液分離效果及離子化效率良好，總離子流圖見(jiàn)圖1（對(duì)照品圖譜略）。

3.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

經(jīng)與對(duì)照品圖譜及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照，并結(jié)合UPLC-MS所測(cè)得化合物的高分辨相對(duì)分子量結(jié)果進(jìn)行成分分析，共鑒定出連翹藥材中的45個(gè)化合物，包括7個(gè)苯乙醇苷類(lèi)成分、5個(gè)木脂素類(lèi)成分、5個(gè)萜類(lèi)成分、12個(gè)黃酮類(lèi)成分、7個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、2個(gè)酚類(lèi)成分、2個(gè)醌類(lèi)成分、2個(gè)苷類(lèi)成分和3個(gè)其他成分，詳見(jiàn)表1。

3.3 化合物質(zhì)譜裂解特征分析

本研究共鑒定出45種化合物，主要包括木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等。選擇每一類(lèi)化合物的代表性化合物，同時(shí)考慮到連翹酯苷A和連翹苷為2015版《中國(guó)藥典》（一部）中連翹項(xiàng)下含量測(cè)定的主要特征性成分，故對(duì)連翹酯苷A、連翹苷、松脂醇、金絲桃苷、漢黃芩苷、阿魏酸和奎寧酸等7種化合物進(jìn)行裂解特征分析。

3.3.1 連翹酯苷A 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苯乙醇苷類(lèi)化合物在連翹中的含量很高，其中主要為連翹酯苷A[6]。35號(hào)化合物在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 623[M-H]-，先脫去1分子鼠李糖，形成碎片離子m/z 461[M-H-C6H10O5]-;然后再脫去1分子H2O，形成碎片離子m/z 443[M-H-C6H10O5-H2O]-;再脫去C13H12O6，形成碎片離子m/z 179[M-H-C6H10O5-H2O-C13H12O6]-;最后再脫去1分子H2O，形成碎片離子m/z 161[M-H-C6H10O5-2H2O-C13H12O6]-。根據(jù)35號(hào)化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為連翹酯苷A，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2，裂解途徑見(jiàn)圖3。

3.3.2 連翹苷 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，連翹苷為連翹的主要活性成分[15]。44號(hào)化合物在ESI+模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 557[M+Na]+，先脫去1分子葡萄糖并發(fā)生氫重排而形成碎片離子m/z 395[M+Na-C6H10O5]+;或者脫去C6H10O6得到碎片離子m/z 379[M+Na-C6H10O6]+;或者脫去2個(gè)五元環(huán)及所連接的甲氧基苯環(huán)得到碎片離子m/z 309[M+Na-C14H16O4]+，后脫去苯環(huán)形成碎片m/z 185[M+Na-C14H16O4-C7H8O2]+。根據(jù)44號(hào)化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為連翹苷，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，裂解途徑見(jiàn)圖5。

3.3.3 松脂醇 18號(hào)化合物在ESI+模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 359[M+H]+，脫去1分子水形成碎片離子m/z 341[M+H-H2O]+，再脫去OCH2形成碎片離子m/z 311[M+H-H2O-OCH2]+，再脫去1個(gè)苯環(huán)形成碎片離子m/z 205[M+H-H2O-2OCH2-C6H4]+，再脫去C5H8O形成碎片離子m/z 151[M+H-H2O-OCH2-C6H4-C5H8O]+，再脫去C5H6O2形成碎片離子m/z 137[M+H-H2O-OCH2-C6H4-C5H6O2]+，最后脫去1分子甲基形成碎片離子m/z 122[M+H-H2O-OCH2-C6H4-C5H6O2-CH3]+。該化合物為首次從連翹中鑒定出，根據(jù)其裂解碎片特征判斷該化合物為松脂醇，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，裂解途徑見(jiàn)圖7。

3.3.4 金絲桃苷 連翹含有大量的黃酮類(lèi)成分，主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮等結(jié)構(gòu)母核，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，連翹中含有金絲桃苷[16]。36號(hào)化合物在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 463[M-H]-，糖鏈均裂脫去1分子半乳糖形成碎片離子m/z 300[M-H-C6H11O5]-;糖鏈異裂脫去1分子半乳糖形成碎片離子m/z 301[M-H-C6H10O5]-;基峰離子m/z 300失去1分子CO和1個(gè)H形成碎片離子m/z 271[M-H-C6H11O5-CO-H]-;碎片離子m/z 301失去1分子CO和1分子H2O形成碎片離子m/z 255[M-H-C6H10O5-CO-H2O]-。根據(jù)36號(hào)化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為金絲桃苷，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖8，裂解途徑見(jiàn)圖9。

3.3.5 漢黃芩苷 43號(hào)化合物在ESI+模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 483[M+Na]+，脫去C6H8O4形成碎片離子m/z 339[M+Na-C6H8O4]+;或者脫去1分子葡萄糖形成碎片離子m/z 321[M+Na-C6H10O5]+。該化合物為首次從連翹中鑒定出，根據(jù)其化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為槲皮苷，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖10。

3.3.6 阿魏酸 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，連翹中含有有機(jī)酸類(lèi)成分，如阿魏酸[17]。37號(hào)化合物在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 193[M-H]-，脫去CH3形成碎片離子m/z 178[M-H-CH3]-，再脫去1分子CO2形成碎片離子m/z 134[M-H-CH2-CO2]-;脫去1分子COOH形成碎片離子m/z 133[M-H-CH3-COOH]-。碎片離子m/z 134脫去CH形成碎片離子m/z 121[M-H-CH2-CO2-CH]-，再脫去CH3形成碎片離子m/z 106[M-H-CH2-CO2-CH-CH3]-。根據(jù)37號(hào)化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為阿魏酸，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖11。

3.3.7 奎寧酸 26號(hào)化合物在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z 191[M-H]-，脫去CH4O3形成碎片離子m/z 127[M-H-CH4O3]-，再脫去1分子水形成碎片離子m/z 109[M-H-CH4O3-H2O]-。該化合物為首次從連翹中鑒定出，根據(jù)其化合物的裂解碎片特征判斷其為奎寧酸，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖12。

4 討論

本研究采用的UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成復(fù)雜成分的分析工作，為連翹的化學(xué)成分鑒定提供了一種高效的分析方法[18-20]。中藥材成分復(fù)雜，且不同成分之間的含量相差懸殊，UPLC系統(tǒng)采用粒徑小于2 ?m的柱填料用于成分分離，與傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)普遍采用的5 ?m柱填料相比，前者理論板數(shù)更高，可獲得更好的分離效果。由于連翹中含有大量的黃酮類(lèi)化合物，因此本課題組在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，以提高黃酮類(lèi)化合物檢測(cè)的靈敏度。質(zhì)譜條件選擇的離子噴霧（ESI+/ESI-）電壓為5 500 V/-4 500 V，在這個(gè)電壓條件下，所有離子都能獲得較高的電離效率。去簇電壓選擇80 V/-80 V，在這個(gè)電壓條件下，可以有效消除溶劑的離子簇，也可防止母離子發(fā)生源內(nèi)裂解。

以往研究多針對(duì)連翹的苯乙醇苷類(lèi)化合物進(jìn)行分析。本研究從連翹中鑒定出的45個(gè)化合物大多為木質(zhì)素類(lèi)、萜類(lèi)、醌類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，可為連翹中其他類(lèi)成分的深入研究提供基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究利用MS的高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)[21]，對(duì)連翹藥材的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，共鑒定出45個(gè)化合物，主要為苯乙醇苷類(lèi)、木脂素類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物，其中有19個(gè)化合物為首次在連翹中得以鑒定;同時(shí)，明確了連翹中苯乙醇苷類(lèi)化學(xué)成分的MS裂解規(guī)律，可為連翹屬藥用植物類(lèi)似化學(xué)成分的MS裂解途徑研究提供參考。這些化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)高分辨MS得到了初步的確定，可為連翹體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)分析，尤其是微量成分的體內(nèi)代謝研究提供方法學(xué)借鑒。

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（收稿日期：2019-05-10 修回日期：2019-09-28）

（編輯：段思怡）