新疆產(chǎn)胡蘿卜籽超臨界CO2萃取物化學成分分析及其抗菌和抗氧化活性考察

祖母來提·圖爾遜 馬慶苓 馬依努爾·拜克力

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3100-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.15

摘 要 目的：研究新疆產(chǎn)胡蘿卜籽超臨界CO2萃取物（簡稱“胡蘿卜籽萃取物”）的化學成分，并初步考察其抗菌和抗氧化活性，為該植物相關產(chǎn)品的開發(fā)及質量控制提供參考。方法：利用超臨界CO2萃取法萃取新疆產(chǎn)胡蘿卜籽中的弱極性揮發(fā)性成分。采用氣質聯(lián)用技術并結合標準譜庫對所得萃取物的化學成分進行鑒定，以峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂培養(yǎng)基平板法考察胡蘿卜籽萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的抗菌活性，同時采用薄層色譜-生物自顯影法考察其抗氧化活性。結果：胡蘿卜籽萃取物中共鑒定出20個化學成分（總相對百分含量為98.76%），主要成分為β-紅沒藥烯、α-細辛腦、α-蒎烯、β-丁香烯、綿馬酚等。胡蘿卜籽萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均具有一定的抑制作用，其最低抑菌濃度分別為0.039、0.833、0.625 mg/mL，最低殺菌濃度分別為0.078、1.667、1.250 mg/mL;該萃取物對1，1-二苯基乙-三硝基苯肼（DPPH）自由基具有一定的清除能力。結論：超臨界CO2萃取所得的新疆胡蘿卜籽萃取物中含有復雜的單萜和倍半萜烯類化合物，并具有一定的抗菌和抗氧化活性。

關鍵詞 新疆;胡蘿卜籽;超臨界萃取;氣質聯(lián)用技術;化學成分;抗菌活性;抗氧化活性

Analysis of Chemical Constituents of Supercritical CO2 Extract from Xinjiang Daucus carota Seed and Its Antibacterial and Antioxidant Activities Study

Zumret·Tursun，MA Qingling，Mahinur·Bakri（Key Lab of Plant Resources and Chemistry in Arid Regions，Chinese Academy of Sciences & National Key Laboratory Breeding Base of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization & Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the chemical constituents of supercritical CO2 extract from Xinjiang Daucus carota seed（called “D. carota seed extract” for short）， and to preliminarily evaluate its antimicrobial and antioxident activity， so as to provide reference for the development and quality control of related products of the plant. METHODS： The non-polar volatile part of Xinjiang D. carota seed was extracted by supercritical CO2 extraction method. The chemical constituents of the extract were identified and quantified by GC-MS and standard spectral labrary. The relative percentage content of each component was calculated by peak area normalization method. The antibacterial activity of D. carota seed extract against Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Candida albicans were investigated by trace broth dilution method and AGAR medium plate method. Its antioxidant activity was investigated by TLC-bioautography method. RESULTS： Twenty chemical constituents were identified from D. carota seed extract （the total relative percentage content was 98.76%）， mainly including β-bisabolene， α-asarone， α-pinene， β-caryophyllene， aspidinol， etc. D. carota seed extract has certain antimicrobial activity on S. aureus， E. coli and C. albicans. The minimum inhibitory concentrations were 0.039， 0.833， 0.625 mg/mL， and minimum bactericidal concentrations were 0.078， 1.667， 1.250 mg/mL， respectively. The extract has a certain scavenging ability to DPPH radical. CONCLUSIONS： D. carota seed extract obtained by supercritical CO2 extraction contains monoterpenes and sesquiterpenes， and possesses certain antibacterial and antioxidant activity.

KEYWORDS ? Xinjiang; Daucus carota seed; Supercritical CO2 extraction;GC-MS;Chemical component; Antibacterial activity; Antioxidant activity

胡蘿卜（Daucus carota L.）是傘形科胡蘿卜屬植物，有“地下小人參”之稱。胡蘿卜籽是胡蘿卜的干燥成熟果實，其藥用記載始于明代的《本草綱目》，是我國習用傳統(tǒng)中藥。胡蘿卜籽在新疆民間常用于利尿通淋、祛寒通經(jīng)、調理經(jīng)水、化排結石，已收載于《中華本草（維吾爾藥卷）》[1]中。不同產(chǎn)地同一種植物的化學成分和生物活性往往存在較大區(qū)別[2]。新疆產(chǎn)胡蘿卜不僅資源豐富，還因其如較大晝夜溫差等特殊的生長環(huán)境，故而具有獨特的口感[3]，而這些特性與其化學成分具有密切的關聯(lián)。然而，筆者經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，新疆產(chǎn)胡蘿卜籽化學成分研究很少，只有對胡蘿卜籽脂肪酸成分或微量元素的分析測定[4-5]，或對其揮發(fā)油進行分析[6]，但對其中具體的弱極性揮發(fā)性成分的研究較少。為了擴大新疆產(chǎn)胡蘿卜籽的藥用部位，充分開發(fā)利用其自然資源，本研究以新疆產(chǎn)胡蘿卜籽為原料，采用超臨界二氧化碳（CO2）流體萃取法提取胡蘿卜籽中的弱極性揮發(fā)性成分，并利用氣質聯(lián)用技術（GC-MS）進行分離和分析，再分別考察萃取物的抗菌活性和抗氧化活性，以期為新疆產(chǎn)胡蘿卜相關產(chǎn)品的開發(fā)及質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FW-100型高速粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）;CPA 124S型電子天平（德國Sartorius公司）;SpeedTM SFE-2型超臨界流體萃取儀（美國Appelied Saparations公司）;Auto System XL GC-TurboMass型GC-MS儀（美國Perkin Elmer公司）;HZ200LB型恒溫搖床（上海精勝科技儀器有限公司）;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海精若科學儀器有限公司）;ATS4型全自動點樣儀、Visua- lizer型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士CAMAC公司）。

1.2 藥品與試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司）;M-H 瓊脂培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180817）;沙氏瓊脂培養(yǎng)基（青島尼賽欣合生物技術有限公司，批號：20181025）;HPTLC正相硅膠60 F254玻璃板（20 cm×10 cm，德國Merck公司）;CO2（新疆康迪實業(yè)發(fā)展有限公司，純度：≥99.5%）;滅菌0.9%生理鹽水（自制）;氯化鈉、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，購自天津市百世化工有限公司;水為蒸餾水。

1.3 藥材

胡蘿卜籽購自新疆恩薩爾維吾爾醫(yī)飲片藥業(yè)有限公司（批號：HLBZ-YP-170926），經(jīng)中國科學院新疆理化技術研究所魯春芳副研究員鑒定為傘形花科植物胡蘿卜屬植物胡蘿卜（D. carota L.）的新鮮種子。

1.4 標準菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 11229）、白色念珠菌（ATCC 10231）均由廣東省微生物培養(yǎng)中心提供。

2 方法

2.1 胡蘿卜籽中弱極性揮發(fā)性成分的萃取

選用胡蘿卜籽，精選除去雜質，以適量水清洗1次，自然風干12 h，粉碎過篩（40目）。取胡蘿卜籽粉末1 kg，以CO2為溶媒，采用超臨界CO2萃取法以超臨界流體萃取儀進行萃取。設置萃取釜體積為5 L、萃取壓力為10 MPa，萃取溫度為28 ℃，萃取時間為2 h;分離釜Ⅰ的壓力為6 MPa、溫度為30 ℃;分離釜Ⅱ的壓力為6 MPa、溫度為34 ℃;CO2的流量為20 kg/h。每0.5 h收集1次萃取物，合并有特殊氣味的淡黃色透明油狀溶液，即得胡蘿卜籽超臨界CO2萃取物（以下簡稱“胡蘿卜籽萃取物”）。共收集獲得胡蘿卜籽萃取物73 g，收率為7.3%。

2.2 胡蘿卜籽萃取物的成分分析

采用GC-MS法進行分析。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：PE-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;載氣：氦氣;柱前壓：14 kPa;程序升溫：柱溫80 ℃保持5 min，以1.5 ℃/min升至200 ℃，再以2.5 ℃/min升至250 ℃，保持30 min;進樣口溫度：270 ℃;進樣量：0.5 μL，分流比：20 ∶ 1。

2.2.2 質譜條件 離子源：電子轟擊離子源（EI）;碰撞電子能量：70 eV;離子源溫度：180 ℃;傳輸線溫度：280 ℃;掃描范圍：35～500 amu。

2.2.3 弱極性揮發(fā)性成分的結構確證及含量計算 采用NIST 2014質譜數(shù)據(jù)庫軟件對檢測到的原始GC-MS圖譜進行化學成分檢索匹配，并結合相關文獻，人工解析質譜圖譜，鑒定并確證化合物結構;同時，采用峰面積歸一法計算各化學成分的相對百分含量。

2.3 胡蘿卜籽萃取物的抗菌活性考察

2.3.1 菌種的復蘇及菌懸液的制備 按無菌操作法[7-8]，將各標準菌株接種至相應的培養(yǎng)基上進行復蘇（細菌用M-H瓊脂培養(yǎng)基在37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h;真菌用沙氏瓊脂培養(yǎng)基在37 ℃條件下培養(yǎng) 24～48 h），轉接到新鮮培養(yǎng)基1次。用滅菌生理鹽水調整菌懸液濃度約為1.5×108 CFU/mL;再取少量菌懸液，按100倍稀釋法用滅菌生理鹽水稀釋至1.5×106 CFU/mL，備用。

2.3.2 胡蘿卜籽萃取物的最低抑菌濃度（MIC）測定采用微量肉湯稀釋法[9-11]進行測定。按無菌操作法[7-8]，取一次性無菌96孔板（每排12孔），分別加入M-H 肉湯培養(yǎng)基100 μL，然后取質量濃度為20 mg/mL的胡蘿卜籽萃取物藥液（以DMSO為溶劑配制）100 μL加入第1孔，混勻后吸取100 μL加入第2孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第10孔，第10孔中吸取100 μL棄去，上述10個孔作為試驗組;第11孔只加培養(yǎng)基和菌液，作為生長對照組，用以觀察培養(yǎng)基是否適合菌株生長;第12孔只加培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)基對照組，用以觀察培養(yǎng)基是否被污染。另吸取1.5×106 CFU/mL的菌懸液各100 μL，依次加入到上述1～11孔中，于搖床上充分混勻，各孔菌濃度均為7.5×105 CFU/mL;吸取M-H肉湯培養(yǎng)基100 μL加入到第12孔中，于搖床上充分混勻。將96孔板加蓋后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出觀察菌株生長情況。在黑色背景光源下，若與生長對照組中生長特性相同（如肉湯渾濁或孔底出現(xiàn)渾濁），則判斷為有菌生長。以無菌生長試驗孔所對應的最低藥物質量濃度記為該藥物的MIC。每種菌株平行操作3次。

2.3.3 胡蘿卜籽萃取物的最低殺菌濃度（MBC）測定采用瓊脂培養(yǎng)基平板法[10]進行測定。分別從“2.3.2”項下未見細菌生長的孔中吸取培養(yǎng)液100 μL，分別接種至M-H瓊脂培養(yǎng)基中，用無菌棉簽均勻涂布，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。用活菌計數(shù)法檢查平板上菌落，以每皿平均菌落數(shù)小于5對應的最低藥物質量濃度記為該藥物的MBC。每種菌株平行操作 3次。

2.4 胡蘿卜籽萃取物的抗氧化活性考察

采用薄層色譜（TLC）-生物自顯影技術[12-13]進行考察。將胡蘿卜籽萃取物用無水乙醇稀釋100倍，分別精密量取1、2、3、4、5 μL點樣于10 cm×10 cm的薄層硅膠板上，然后以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3 ∶ 1 ∶ 05，V/V/V）為展開系統(tǒng)進行展開，晾干，分別在366、254 nm紫外燈下觀察斑點的數(shù)量和大小。

取上述展開后的薄層板，噴以含0.04%DPPH的乙醇溶液，于40 ℃下加熱30 min后在自然光下觀察[12-13]。在薄層板粉色背景下，樣品展開后的白色斑點顏色越深、面積越大，則表明該成分對DPPH 自由基的清除活性越強，以評價藥物的抗氧化活性。

3 結果

3.1 胡蘿卜籽萃取物的GC-MS分析結果

經(jīng)GC-MS分析，獲得胡蘿卜籽萃取物的總離子流圖（見圖1）。結合質譜圖，經(jīng)計算機檢索并結合文獻調研，共鑒定出20個化合物;同時，經(jīng)峰面積歸一化法計算其相對百分含量，所鑒定出的化合物總相對百分含量為98.76%，結果見表1。

3.2 胡蘿卜籽萃取物的抗菌活性

抗菌試驗結果顯示，胡蘿卜籽萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，詳見表2。

3.3 胡蘿卜籽萃取物的抗氧化活性

在366、254 nm紫外燈下可以看到8個清晰斑點，分離效果較好，表明胡蘿卜籽萃取物中各個成分得到了有效分離，詳見圖2A、2B。經(jīng)DPPH反應后顯示，8個斑點均呈不同深淺的白色，表明胡蘿卜籽萃取物中的大部分化學成分都具有DPPH自由基清除能力，提示其具有一定的抗氧化活性，詳見圖2C。

4 討論

胡蘿卜籽雖在古籍中早有記載，具有明顯的防治疾病和增強機體免疫能力，但目前在保健和醫(yī)療領域的應用很少，市場上主要的相關保健產(chǎn)品有胡蘿卜汁、胡蘿卜營養(yǎng)咀嚼片、胡蘿卜保健酒等[14]。中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，國家鼓勵運用現(xiàn)代科學技術和傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究方法開展中醫(yī)藥科學研究，以促進中醫(yī)藥理論和技術方法的繼承和創(chuàng)新。胡蘿卜籽作為傳統(tǒng)的藥食同源類中藥，研究者應充分利用其活性成分，開發(fā)為功能性食品、藥品、保健品等，使該植物資源的利用價值最大化。

本研究采用超臨界CO2萃取新疆產(chǎn)胡蘿卜籽的弱極性揮發(fā)性部位，并通過體外活性測試方法證實其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均具有抑制活性，對DPPH自由基具有明顯的清除能力，這與其化學成分有關。GC-MS分析結果顯示，胡蘿卜籽萃取物中含有大量復雜的單萜和倍半萜烯類化合物，主要包括β-紅沒藥烯、α-細辛腦、α-蒎烯、β-丁香烯、綿馬酚等活性成分。其中，β-紅沒藥烯是一種很好的抗氧化劑，具有抗氧消炎之功效[15];α-細辛腦具有抗菌消炎、止咳、祛痰、平喘、鎮(zhèn)靜、解痙、抗驚厥、抗癲癇等藥理作用[16];α-蒎烯有明顯的鎮(zhèn)咳和祛痰作用，并有抗真菌作用;β-丁香烯具有一定的平喘作用，是治療老年慢性支氣管炎的有效成分之一[17];綿馬酚具有抗微生物、驅蟲作用，在臨床上可用作驅腸蟲劑[18];α-石竹烯具有一定的平喘作用，可用于治療老年慢性支氣管炎;石竹烯氧化物則可治療皮膚霉菌病，尤其適用于短期治療甲霉菌病，同時還具有祛風除濕、清熱解毒、利尿消腫的功效[19]。

綜上，本研究通過對新疆產(chǎn)胡蘿卜籽超臨界CO2萃取物化學成分的分析及其抗菌、抗氧化等生物活性的初步評價，為新疆產(chǎn)胡蘿卜資源的合理利用提供了一定依據(jù)。但該植物中具有抗菌和抗氧化活性的具體有效成分及其機制仍有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-11-29 修回日期：2019-09-27）

（編輯：段思怡）