習(xí)浩 劉榮靜

摘要：目的? 評價ARCHETECT高敏肌鈣蛋白Ⅰ（hs-cTnⅠ）試劑盒性能，以驗證其是否符合臨床實驗室使用要求。方法? 參考CLSI的EP15-A2文件和相關(guān)文獻對ARCHETECT高敏肌鈣蛋白Ⅰ試劑盒精密度、正確度進行評價，EP17-A文件和相關(guān)文獻對空白檢測限（LoB）進行評價，EP6-A文件和相關(guān)文獻對線性范圍進行評價，參考NCCLS C28-A2文件，對健康體檢者血漿標本分男女驗證生物參考區(qū)間。結(jié)果? 實驗測得hs-cTnⅠ高值樣本（5.702 μg/L）的批內(nèi)不精密度CV為1.56%，總不精密度CV為1.27%，低值樣本（0.003 μg/L）的批內(nèi)不精密度CV和總的不精密度CV均為0;hs-cTnI的回收率為 97.50%;LoB為0.001 μg/L;在檢測范圍內(nèi)，hs-cTnI理論值與測定值的線性方程為Y=1.0006X-0.13136，R2=0.9999;生物參考區(qū)間驗證結(jié)果顯示男性100.00%的結(jié)果在廠家提供的生物參考區(qū)間范圍內(nèi)，女性96.67%的結(jié)果在廠家提供的生物參考區(qū)間范圍內(nèi)。結(jié)論? ARCHETECT高敏肌鈣蛋白Ⅰ試劑盒性能通過驗證，可為臨床提供準確、可靠的hs-cTnⅠ定量檢測結(jié)果，為臨床對心肌損傷的診斷、治療提供重要信息。

關(guān)鍵詞：高敏肌鈣蛋白Ⅰ;性能;精密度;正確度;生物參考區(qū)間

Abstract：Objective? To evaluate the performance of the ARCHETECT high-sensitivity cardiac troponin I （hs-cTnI） kit to verify compliance with clinical laboratory requirements.Methods? The accuracy of the ARCHETECT high-sensitivity troponin I kit were evaluated with reference to the CLSI EP15-A2 document and related literature. The blank detection limit （LoB） was evaluated in EP17-A and related literature， EP6-A and The relevant literature evaluates the linear range. Referring to the NCCLS C28-A2 document， the plasma samples of healthy subjects are compared with the male and female validated biological reference intervals.Results? The intra-assay imprecision CV of the hs-cTnI high value sample （5.702 μg/L） was 1.56%， the total imprecision CV was 1.27%， and the intra-assay imprecision of the low-value sample （0.003 μg/L）. The CV and the total imprecision CV were both 0; the recovery of hs-cTnI was 97.50%; the LoB was 0.001 μg/L; in the detection range， the linear equation of the theoretical and measured values of hs-cTnI was Y=1.0006X-0.13136， R2=0.9999; the bio-reference interval verification results showed that 100.00% of the results were within the bio-reference interval provided by the manufacturer， and 96.67% of the results were within the bio-reference range provided by the manufacturer.Conclusion? The performance of ARCHETECT high-sensitivity troponin I kit can provide accurate and reliable quantitative detection results of hs-cTnI for clinical diagnosis， and provide important information for clinical diagnosis and treatment of myocardial injury.

Key words：High-sensitivity cardiac troponin I;Performance;Precision;Accuracy;Biological reference interval

cTnⅠ因具有特異性強、靈敏度高、發(fā)病后出現(xiàn)較早且持續(xù)時間較長等特點，成為目前反應(yīng)心肌損傷靈敏度和特異度較高的生物學(xué)標志物，廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死（AMI）的早期診斷。2012年歐洲心臟病協(xié)會（ESC）、美國心臟病學(xué)會（AHA）和世界心臟聯(lián)盟（WHF）聯(lián)合提出將cTnⅠ作為心肌損傷的首選標志物，2018年ESC會議期間，第四版心肌梗死全球統(tǒng)一定義公布，新的定義中再次強調(diào)cTn的重要性，包括高敏肌鈣蛋白的重要價值[1]。近年來，隨著檢驗技術(shù)的不斷進步，新一代高敏感方法檢測的試劑相繼問世，許多產(chǎn)商紛紛推出hs-cTnI檢測試劑，因此，對其性能進行評估、驗證是合理地選擇cTnⅠ檢測方法、保障臨床結(jié)果準確性的重要環(huán)節(jié)。本研究根據(jù)ISO15189《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可》的要求，參考美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）發(fā)布的EP15-A2、EP17-A、EP6-A文件[2]及其它相關(guān)文獻對雅培公司生產(chǎn)的高敏肌鈣蛋白Ⅰ試劑盒的主要相關(guān)性能進行評價、驗證。

1材料與方法

1.1 材料? ①hs-cTnⅠ低值樣品組：收集無心血管、肝、膽、腎、肺等器質(zhì)性疾病，心電圖檢查正常，無急性炎癥，半年內(nèi)均無大手術(shù)、輸血史，血脂、血清肌酐等正常，查詢資料半年內(nèi)均無心血管事件發(fā)生的表面健康人60名的血漿，年齡18～78歲，其中男30人，女30人。②hs-cTnⅠ高值樣品組：收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2018年8月～11月疑似或確診AMI患者樣本50例，樣本無黃疸、溶血、脂血。

1.2方法

1.2.1標本采集? 收集當(dāng)天符合要求的標本，分離血漿于EP管中，至于-20℃冰箱中保存，僅凍融1次。

1.2.2儀器和試劑? 儀器為雅培i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，使用配套hs-cTnⅠ試劑盒。

1.2.3精密度評估? 根據(jù)EP15-A2文件《用戶對精密度和正確度性能的驗證試驗》。將健康者hs-cTnⅠ低值新鮮血漿混合后測出濃度為0.003 μg/L，分裝5管，每管800 μL;hs-cTnⅠ高值標本同理，混合后濃度大約5 μg/L。在儀器運行正常、質(zhì)控在控的情況下，每天分析1個批次，高、低值2個濃度，每個濃度重復(fù)測量3次，連續(xù)測量5 d，記錄數(shù)據(jù)，計算均值、標準差、批內(nèi)不精密度及總不精密度。

1.2.4正確度評估? 根據(jù)CLSI的EP15-A2《用戶對精密度和正確度性能的驗證試驗》文件，將已知濃度校準液（校準液1濃度為10 μg/L;校準液2濃度為50 μg/L）分別加入患者樣本（患者樣本濃度為4.118 μg/L）中，成為回收樣本1、回收樣本2，原患者樣本加入相同量的無分析物溶液（健康者血漿樣本）作基礎(chǔ)樣本。樣本制備方式如下：①基礎(chǔ)樣本：患者標本0.9 ml+健康者標本0.1 ml;②回收樣本1：患者標本0.9 ml+校準液1（10 μg/L）0.1 ml;③回收樣本2：患者標本0.9 ml+校準液2（50 μg/L）0.1 ml，每個樣本各測3次，計算回收率。

1.2.5空白限（LoB）評估? CLSI的EP17-A《確定檢出限和定量檢出限方案》確定LoB。生理鹽水做為空白樣本每天下午測定一批生理鹽水，每批重復(fù)測定3次，連續(xù)測5 d。因儀器直接報告的是濃度值，hs-cTnⅠ濃度值在低值時往往不呈正態(tài)分布，因而采用非參數(shù)方法估算第95百分位數(shù)[3]。即將數(shù)據(jù)由小到大排列，第95百分位數(shù)所在位置為空白樣品總數(shù)×（95/100）+0.5。

1.2.6線性范圍評估? 根據(jù)CLSI的EP6-A《定量測量程序的線性評價：統(tǒng)計學(xué)方法》文件，取已知濃度的hs-cTnⅠ低值（濃度為0.002 μg/L）和高值（濃度為61.377 μg/L）血漿各1份，并按照高值：低值比例為5：1、2：1、1：1、1：2、1：5混成不同濃度值的血漿5份，加上低值、高值血漿共7份，每個樣本測定2次，計算實際測得平均值，同時根據(jù)樣本稀釋方案計算預(yù)期值，后進行相關(guān)回歸統(tǒng)計分析。

1.2.7生物參考區(qū)間評估? 選擇表面健康人（入選標準與低值樣本組相同）血漿，其中男性30人，女性30人，60個檢測數(shù)據(jù)如果不能在同一天獲得，則當(dāng)天留取的標本當(dāng)天測定。按標準操作規(guī)程進行檢測并對所得結(jié)果逐一驗證是否在現(xiàn)有的參考區(qū)間內(nèi)，若實驗對象的測定值有95%以上在所選擇的參考區(qū)間內(nèi)，可以接受。否則，需建立合適的參考區(qū)間。

2結(jié)果

2.1精密度評估? 高（5.702 μg/L）、低（0.003 μg/L）兩個濃度混合血漿的批內(nèi)不精密、總的不精密度符合要求，見表1。

2.2正確度評估? hs-cTnⅠ的平均回收率為97.50%，見表2。

2.3空白檢出限評估? 空白樣本的檢測結(jié)果呈非正態(tài)分布，故用非參數(shù)程序估計LoB，即估計第95%分位數(shù)的值，LoB=30×（95/100）+0.5=29位置的結(jié)果。將30個空白檢測值由小到大排序，第29位置的結(jié)果為0.001 μg/L，即LoB=0.001 μg/L。在廠家聲明的LoB范圍（0.0007～0.0013μg/L）之內(nèi)，見表3。

2.4線性范圍評估? 測定值為2次測定結(jié)果的平均值，與理論值做線性對比，通過計算、擬合，得出線性方程為Y=1.0006X-0.13136，R2=0.9999。線性樣本檢測結(jié)果見表4，線性曲線見圖1。

2.5生物參考區(qū)間評估? 按NCCLS C28-A2 推薦方法，驗證現(xiàn)廠家提供的生物參考區(qū)間。根據(jù)測定結(jié)果顯示，男性100.00%（30/30）的表面健康個體的檢測結(jié)果落在現(xiàn)用生物參考區(qū)間的內(nèi)，女性97.60%（29/30）的表面健康個體的檢測結(jié)果落在參考區(qū)間內(nèi)，說明廠家聲明的生物參考區(qū)間有效，適用于本實驗室，見表5。

3 討論

肌鈣蛋白是疑似急性冠脈綜合征患者危險分層及心肌梗死診斷的首選生物標志物，截斷值為第99百分位值。高敏肌鈣蛋白可檢測輕微的心肌損傷，可幫助臨床更早診斷及決定治療方案[1]。ARCHETECT高敏肌鈣蛋白Ⅰ作為第三代高敏肌鈣蛋白檢測方法，在低于第99百分位值時可檢出的表觀健康人群比例達96%，其試劑盒在臨床實驗室中使用是否可達到廠家聲明的性能指標，在使用前必須按要求進行評價、驗證。

精密度可以反映分析過程中隨機誤差的大小，是儀器整體性能首要指標，是臨床檢驗的方法評價重要指標之一[4]。它是進行其他性能驗證實驗的前提，良好的精密度和準確度可為臨床檢測標本及后續(xù)實驗提供合理可靠的檢測結(jié)果。本實驗結(jié)果顯示，高值樣本混合血漿的批內(nèi)不精密和總的不精密度CV分別1.56%和1.27%，低值樣本混合血漿的批內(nèi)不精密和總不精密度CV均為0 。與廠家聲明的室內(nèi)不精密度CV≤10%對比，符合要求，該試劑盒具有良好的精密度，同時也保證了后面所展開的實驗的合理可靠性。

回收試驗中，校準液低值樣本的回收率為96.40%，校準液高值樣本的回收率為98.60%，一般情況下，加入分析物濃度高的樣本比加入分析物濃度低的能有更好的回收率。在測定條件相同的情況下，這種差異的造成主要由基質(zhì)效應(yīng)引起，也就是商業(yè)化校準品、質(zhì)控品由于與人血清基質(zhì)的不同而導(dǎo)致了回收試驗回收率的不同，反而言之，即回收率的差異反映了樣本的基質(zhì)效應(yīng)。通常，儀器生產(chǎn)廠家和試劑生產(chǎn)廠家會由回收試驗去評估所用分析方法是否受基質(zhì)效應(yīng)的影響，因為它直接影響著檢驗報告的準確性。本次實驗借由校準品處理的樣本帶來的基質(zhì)效應(yīng)，得到平均回收率為97.50%，與理想結(jié)果回收率100.00%較接近，基質(zhì)效應(yīng)影響較小，正確度好，可保證日常檢驗報告單結(jié)果的準確和可靠。

LoB是指在規(guī)定的可能性條件下，空白樣品觀察到的最大檢測結(jié)果，空白樣品重復(fù)測量結(jié)果的離散分布是隨機測量誤差所致[3]。當(dāng)空白樣本的檢測結(jié)果呈非正態(tài)分布，需采用非參數(shù)程序估計LoB，本實驗估計得LoB為0.001 μg/L，在廠家聲明的LoB范圍（0.0007～0.0013 μg/L）之內(nèi)。

廠家提供的ARCHETECT高敏肌鈣蛋白Ⅰ試劑盒性的檢測上限是50 μg/L，本實驗為很好地驗證其線性范圍，故選用高值濃度為超出廠家所給上限濃度的10%～15%內(nèi)的61.377 μg/L樣本，按比例稀釋測定后做線性回歸分析得出理論值與測量值得線性方程為Y=1.0006X-0.13136，R2=0.9999。R2接近于1，線性相關(guān)性非常好。

正確適用的生物參考區(qū)間，對臨床有重要的價值，否則易導(dǎo)致誤診、漏診情況的發(fā)生，因此，驗證一個試劑盒的生物參考區(qū)間是否適用于本實驗室也成為試劑盒性能評價的項目之一。本實驗按CLSI推薦的C28-A2文件方法，驗證現(xiàn)廠家提供的生物參考區(qū)間。根據(jù)測定結(jié)果顯示，男性100.00%的表面健康個體的檢測結(jié)果落在現(xiàn)用男性參考區(qū)間內(nèi)，女性96.67%的表面健康個體的檢測結(jié)果落在女性參考區(qū)間，說明廠家聲明的生物參考區(qū)間有效，適用于本實驗室。

綜上所述，依據(jù)CLSI EP系列文件、C28-A2文件及常規(guī)方法對雅培公司生產(chǎn)的ARCHETECT高敏肌鈣蛋白I試劑盒的精密度、正確度、空白檢測限、線性范圍以及生物參考區(qū)間進行了評價，實驗結(jié)果顯示驗證通過，可為臨床提供準確、可靠的hs-cTnⅠ定量檢測結(jié)果，為臨床對心肌損傷的診斷、治療提供重要信息。

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收稿日期：2019-4-9;修回日期：2019-4-29

編輯/成森