劉海鵬（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北 衡水 053000）

沙門氏菌被認為是引起魚、龜?shù)人a(chǎn)養(yǎng)殖品種腐皮病的致病菌之一，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。隨著抗菌藥物在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，沙門氏菌的耐藥性越來越高。沙蠶是一類生活在海邊潮間帶的海洋生物，體內(nèi)含有多種生物活性成分，是可利用的重要的藥物資源，因此研究和開發(fā)沙蠶體內(nèi)抗菌活性成分對解決耐藥菌株有重要意義。本試驗采用甲醇對沙蠶體內(nèi)活性物質(zhì)進行提取，通過提取物對沙門氏菌進行體外抑菌實驗，為沙蠶體內(nèi)生物活性物質(zhì)的開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品與菌株。沙蠶，采購于山東舟山某水產(chǎn)養(yǎng)殖場。沙門氏菌，衡水學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 主要儀器。電熱鼓風(fēng)干燥箱、XDSY-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SW-CT-IF超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、超聲波震蕩儀。

2 方法

2.1 沙蠶提取物的制備。將清水洗凈的沙蠶烘干、粉碎后研磨成粉末狀，將甲醇和沙蠶混勻，超聲波震蕩儀中震蕩30 min，重復(fù)3次，所得濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最后所得溶液用甲醇稀釋至濃度為100 mg/ml，高壓滅菌后，放于4℃冰箱保存，備用。

2.2 菌懸液的制備。無菌條件下，將活化的沙門氏菌接種至LB培養(yǎng)基進行恒溫培養(yǎng)并計算菌懸液濃度。取1 ml已制備好的菌懸液加9 ml無菌水進行10倍倍比稀釋，取1×10-5～1×10-95種稀釋度涂板，每個濃度做3個平行，做好標(biāo)記，將涂好后的培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2 d。選擇每個平板上長有50～300個菌落的稀釋度進行菌落計數(shù)。計算公式：1 ml樣品中菌落形成單位數(shù)(CFU)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)，最后配置成濃度為1×106cfu/ml的菌液備用。

2.3 沙蠶提取物最小抑菌濃度(MIC)的測定。采用試管二倍稀釋法測定每種沙蠶活性提取物的最低抑菌濃度(MIC)。取已處理好的無菌試管，通過試管二倍稀釋法，制備試管提取物濃度為12.5 mg/ml、3.13 mg/ml、0.78 mg/ml、0.195 mg/ml、0.098 mg/ml、0.049 mg/ml，同時做空白對照和溶劑對照，空白對照不含提取物藥液，溶劑對照不含提取物卻含有等劑量相應(yīng)溶劑。

2.4 體外抑菌圈直徑測定。利用牛津杯法測定沙蠶提取物體外抑菌圈直徑。用移液槍吸取100 μl沙蠶提取物注入牛津杯內(nèi)，將平板培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑制圈的直徑大小。每種提取物做3個重復(fù)，取平均值。結(jié)果判定，抑菌圈直徑小于10 mm為輕度抑菌，抑菌圈直徑10～15 mm為中度抑菌，抑菌圈直徑15～20 mm為高度抑菌，抑菌直徑大于20 mm為極度抑菌。

3 結(jié)果與討論

3.1 體外抑菌圈的測定。結(jié)果見表1。由表1可知甲醇沙蠶提取物對沙門氏菌有中度抑菌效果。其抑菌圈直徑平均值為9.28 mm，空白對照組與甲醇抑菌圈直徑為0 mm，無抑菌效果。

表1 不同沙蠶提取物體外抑菌圈直徑(mm)

3.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定。結(jié)果見表2。由表2可知，甲醇沙蠶提取物對沙門氏菌的MIC值為0.098 mg/ml。

表2 甲醇沙蠶提取物對沙門氏菌MIC的測定(mg/ml)

3.3 討論。本試驗通過使用甲醇對沙蠶體內(nèi)活性物質(zhì)提取并進行抗菌試驗，發(fā)現(xiàn)其提取物對沙門氏菌具備一定的抗菌性，而甲醇本身對沙門氏菌無抑菌性，表明沙蠶體內(nèi)的生物活性物質(zhì)對沙門氏菌有抗菌效果，本研究為沙門氏菌相應(yīng)抗菌藥的開發(fā)打下了一定的基礎(chǔ)。值得注意的是，在甲醇粗提物中哪一種成分起到主要作用尚不可知，需要深入研究。而當(dāng)前對沙蠶體內(nèi)活性物質(zhì)的研究主要集中在沙蠶毒素的抗癌、抗氧化作用上，本研究結(jié)果為進一步開發(fā)沙蠶體內(nèi)活性物質(zhì)提供了一個新的方向。