王占娣，李 嫻，孫 龍，丁偉峰，馮 穎

(1.中國林業(yè)科學院，云南 昆明650233;2.玉溪師范學院，云南 玉溪653100)

雄激素性脫發(fā)又稱脂溢性脫發(fā)，是臨床最常見的脫發(fā)類型，其致病機制有多種假說，多數(shù)學者認為其與雄激素的異常表達及其代謝過程有關(guān)[1]，5α-還原酶的活性及其催化生成的二氫睪酮是導致毛發(fā)脫落的主要原因[2-3]。目前，針對脂溢性脫發(fā)致病機制開發(fā)的藥物有雄激素受體抑制劑、促性腺激素釋放激素(GnRH)受體拮抗劑和5α-還原酶抑制劑3類。這些藥物主要作用于雄激素受體或5α-還原酶，調(diào)節(jié)紊亂的激素水平。白蠟是由白蠟蟲半翅目蚧總科白蠟蚧屬雄性幼蟲分泌的次生代謝物質(zhì)漂洗加工而成[4]，《集玄方》記載：“頭上禿瘡，蠟燭頻涂，勿令日曬，久則自然生發(fā)?！闭f明白蠟治療脫發(fā)有一定作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，白蠟?zāi)艽龠M脂溢性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)的生長，但對其治療脂溢性脫發(fā)的機制尚不明確。因此，本文以KM小鼠和人真皮乳頭細胞(HFDPC)為模型生物，探討白蠟對脂溢性脫發(fā)模型小鼠體內(nèi)激素水平、5α-還原酶活性和二氫睪酮誘導的HFDPC生長的調(diào)節(jié)作用，為白蠟生發(fā)產(chǎn)品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 白蠟(四川峨眉白蠟研究所);實驗動物：KM小鼠為5周齡雄鼠[成都達碩科技有限公司，證書號：3 cdk(川)2013-24]，室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度為室溫，光照為自然光，飼喂人工飼料，食物和水不限量供應(yīng);HFDPC和人毛囊真皮乳頭細胞生長培養(yǎng)基(美國Cell Applications公司);丙酸睪酮(杭州動物藥品廠);非那雄胺(大連美侖生物技術(shù)有限公司);Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(美國Promega公司);滅菌大豆油為食品級大豆油150℃干熱滅菌4 h;無水乙醇和1，2-丙二醇為分析級。

1.2 樣品制備 丙酸睪酮溶解于滅菌大豆油，濃度為5 mg/m L;非那雄胺用有機溶劑(乙醇∶丙二醇=80∶20)配制，濃度為2%;高級烷醇用有機溶液(乙醇∶丙二醇=80∶20)配制，濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%，備用;稱取適量T和非那雄胺溶解于95%乙醇中制備成濃度為1 mol/L的T溶液和濃度為10μg/m L的非那雄胺溶液，備用;稱取適量乙二胺四乙酸(EDTA)溶解于蒸餾水中，濃度為10 mg/m L，備用。

1.3 動物分組與處理 將36只KM小鼠隨機分成6組，每組6只。動物模型的建立參照RENUKA等[5]的報道。6組分別為CK組(不進行任何處理)、模型組(皮下注射丙酸睪酮0.1 m L)、陽性對照組(皮下注射丙酸睪酮0.1 m L加局部涂抹2%非那雄胺0.5 m L)、實驗組(皮下注射丙酸睪酮0.1 m L的同時局部分別涂抹5.0%、10.0%和15.0%白蠟0.5 m L)，連續(xù)給藥60 d。

1.4 激素含量的測定 給藥第60日每組隨機選3只小鼠，采集心臟血，室溫靜置30 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心10 min，用一次性注射器抽取上層血清。采用睪酮(T)和雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫試劑盒測定小鼠血液中T和E2的含量。測定樣品和標準品的吸光度值，酶標儀波長為450 nm，重復(fù)3次。采用Excel表繪制標準濃度與OD值的標準曲線，計算標準曲線的直線回歸方程，將樣品OD值代入回歸方程中計算樣品中激素的含量。

1.5 5α-還原酶提取 取4周齡體質(zhì)量為18～22 g健康的KM小鼠，禁食不禁水，過夜脫頸處死，在冰上提取小鼠附睪，剪碎，稱重，加入3倍量預(yù)冷均漿液，在玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液于4℃、3 500 g離心10 min，離心2次。取上清液，再次于4℃、10 000 g離心50 min，取上清液，分裝。保存于-80℃冰箱，用考馬斯亮藍測定蛋白含量。

1.6 白蠟對5α-還原酶的抑制作用 在5 mL的離心管中添加0.1 mL 1 mmol/L睪酮溶液、0.1 mL EDTA水溶液、0.3 mL的5α-還原酶和0.3 mL不同濃度白蠟溶液(濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)或非那雄胺溶液(濃度分別為0.012 5、0.062 5、0.125 0、0.250 0 mg/mL)，用 20 mmol/L磷酸鈉溶液補足到1.5 m L，混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min，加入3 m L乙酸乙酯終止反應(yīng)。漩渦震蕩1 min，3 500 rpm離心10 min，取有機層，蒸干，添加2 m L甲醇。采用高效液相(HPLC)測定T的含量，根據(jù)T標準曲線，計算樣品反應(yīng)后溶液中殘留的T含量。按照下列公式計算：T反應(yīng)量=C0min-C60min，C為反應(yīng)體系中T的量;T轉(zhuǎn)化率=(Mck-M樣品)/Mck×100%，M為T的轉(zhuǎn)化量;5α-還原酶抑制率=(Rck-R樣品)/Rck×100%。

1.7 白蠟抑制二氫睪酮與受體的結(jié)合 采用MTS法測定白蠟對二氫睪酮與受體結(jié)合的抑制作用。HFDPC(2.5×103個/孔)接種到96孔板中，貼壁后在每個孔中添加終濃度為1×10-4的二氫睪酮溶液，同時添加終濃度為5、2.5、1.26、0.625μg/m L的白蠟，以0.2μmol/L非那雄胺溶液為陽性對照，只添加T溶液的細胞作為空白對照，每個處理4個復(fù)孔，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)48 h。每孔加20μL MTS試劑培養(yǎng)4 h，490 nm測定細胞數(shù)量，并計算細胞增殖率。細胞增殖率=(OD處理組-ODCK組或模型組)/ODCK組或模型組×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組計量資料比較采用ANOVA法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 激素水平比較 白蠟組T含量隨著白蠟濃度的增加而增加。給藥60 d后，5%、10%的白蠟組T含量明顯低于模型組(P＜0.05)，高于陽性對照組(P＜0.05)。10%白蠟組E2含量均明顯高于5%、20%白蠟組、陽性對照組和模型組(P＜0.05)，T/E2明顯小于模型組(P＜0.05)，大于陽性對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 給藥第60 d后各組雄激素性脫發(fā)模型小鼠激素比較(±s)

表1 給藥第60 d后各組雄激素性脫發(fā)模型小鼠激素比較(±s)

注：與模型組比較，△P＜0.05;與陽性對照組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) T(pmol/L) E2(pmol/L) T/E2 CK組 3 1 337 887.80±11 659.48△▲ 187.49±15.07△▲ 718.13±65.90△模型組 3 154 983.20±13 966.57▲ 179.44±12.76 873.22±97.68▲陽性對照組 3 119 240.80±3 022.49△ 180.64±4.21△ 660.93±24.56△5%白蠟組 3 132 769.50±1 142.05△▲ 179.66±22.75△ 762.23±91.87△▲10%白蠟組 3 139 994.30±3 282.15△▲ 192.41±2.44△▲ 727.77±18.11△▲20%白蠟組 3 154 961.60±11 957.80▲ 172.51±6.69△▲ 897.13±50.95△▲

2.2 對5α-還原酶的抑制作用比較 白蠟和非那雄胺可以明顯降低T轉(zhuǎn)化二氫睪酮的能力，抑制5α-還原酶的活性。隨著二者濃度的增加，T的反應(yīng)量和轉(zhuǎn)化率均降低，5α-還原酶的抑制率增加。白蠟和非那雄胺對5α-還原酶的抑制中濃度分別為1.66μg/m L、0.07μg/m L。見表2、表3。

表2 白蠟對5α-還原酶的抑制作用

表3 非那雄胺對5α-還原酶的抑制作用

2.3 白蠟抑制二氫睪酮與受體的結(jié)合 隨著白蠟濃度的增加，HFDPC增殖率降低。白蠟濃度為0.063 ppm時，對二氫睪酮模型細胞的增殖效果最為明顯，其值與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);濃度為1.56 ppm時HFDPC的增殖率明顯低于陽性對照組(P＜0.05)，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);白蠟濃度高于3.12 ppm時，細胞增殖率明顯降低，且低于模型組(P＜0.05)。見表4。

表4 白蠟對二氫睪酮模型細胞的增殖作用

3 討論

文獻報道顯示，激素水平紊亂是導致雄激素性脫發(fā)的主要原因[1，6-7]。T與E2是維持體內(nèi)激素水平的重要激素，與性別關(guān)系密切。對女性而言，T和E2均由機體直接分泌;對于男性而言，T由機體直接分泌，其在芳香酶的作用下可產(chǎn)生E2。正常情況下，T與E2共同維護機體激素水平的平衡。若機體激素水平失衡則會對毛囊的生長造成較大的危害。因此，調(diào)節(jié)體內(nèi)T和E2的含量，使其比值維持在正常范圍是治療雄激素脫發(fā)的有效措施之一[8]。本實驗中，筆者通過測定小鼠體內(nèi)T、E2的含量，計算T與E2的比值，評價白蠟對激素的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，皮下注射丙酸睪酮建立雄激素性脫發(fā)模型小鼠，給藥60 d后，小鼠體內(nèi)的T/E2比值明顯升高，局部涂抹10%白蠟后小鼠體內(nèi)T/E2比值明顯低于模型組(P＜0.05)，與CK組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明白蠟?zāi)苷{(diào)節(jié)雄激素性脫毛模型小鼠體內(nèi)紊亂的激素水平。

雄激素性脫發(fā)激素水平的紊亂并不是T直接作用的結(jié)果，而是頭部大量集聚的T在Ⅱ型5α-還原酶催化下產(chǎn)生的二氫睪酮穿透細胞膜與雄激素性受體結(jié)合后，進入毛囊細胞，破壞DNA的表達，誘發(fā)HFDPC衰退[9]。有文獻報道，抑制5α-還原酶活性及阻止雄激素與受體結(jié)合是雄激素性脫發(fā)藥物作用的靶標位點，某些外源性的物質(zhì)能抑制5α-還原酶活性，阻止二氫睪酮對HFDPC的傷害[10]。目前國際上公認的治療雄激素脫發(fā)的藥物非那雄胺可同時作用于這兩個位點[11-13]。本次研究結(jié)果顯示，白蠟?zāi)軌蛞种?α-還原酶活性，降低T轉(zhuǎn)化率，同時一定濃度范圍內(nèi)還能促進二氫睪酮誘導的HFDPC增殖，其抑制5α-還原酶的濃度高于陽性對照組(非那雄胺)(P＜0.05)，而白蠟用量為0.063 ppm時促進細胞增殖效果與非那雄胺比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明白蠟?zāi)軌蛞种?α-還原酶活性，一定濃度范圍內(nèi)可阻止二氫睪酮與受體的結(jié)合，其抑制5α-還原酶活性低于非那雄胺，但一定濃度時其阻止二氫睪酮與受體結(jié)合的能力與非那雄胺無差異。

本研究結(jié)果顯示，白蠟?zāi)芙档托∈篌w內(nèi)T的表達量。由于雄性小鼠不能直接分泌E2，其由T在芳香酶的催化下生成。由此推測，白蠟對芳香酶的活性或其催化T生成E2的生化過程具有調(diào)節(jié)作用，但具體作用機制有待進一步驗證。

綜上所述，白蠟對雄激素及其代謝過程均具有調(diào)節(jié)作用，其可通過調(diào)節(jié)紊亂的激素水平，抑制5α-還原酶活性，阻止二氫睪酮與受體的結(jié)合，促進雄激素性脫發(fā)毛發(fā)的生長。