甘小蓉，王 超，楊超慧

(1. 河海大學 淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，南京 210098；2. 河海大學 環(huán)境學院，南京 210098)

1 前 言

水華一直是當代水環(huán)境污染問題中比較重要且突出的一項，其中隸屬藍藻門的銅綠微囊藻是造成水華現(xiàn)象的罪魁禍首之一。銅綠微囊藻能夠產(chǎn)生毒性很強的微囊藻毒素，藻毒素在水體中擴散會影響自然水體生態(tài)功能，進而危害人體健康和影響社會穩(wěn)定。

為了解決水體富營養(yǎng)化這一問題，上個世紀八十年代開始到今天國內(nèi)外學者已經(jīng)做了大量的研究，得出的控藻抑藻的方法主要有物理法、化學法和生物法等[1～5]；除此之外，超聲波除藻技術(shù)也得到了相應的研究與發(fā)展，但是其存在較大的安全隱患，可能會對周圍水生動、植物造成不利的影響[6～8]。近年來，水生植物分泌的次生代謝物質(zhì)對藻類的化感抑制作用逐漸成為了領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點。

大量的現(xiàn)場試驗以及實驗室研究均表明水生植物可以分泌和釋放一些化學物質(zhì)對引起水華的藻類產(chǎn)生抑制效應，從而控制藍藻水華的產(chǎn)生[9-10]。而化感物質(zhì)作為植物次生代謝物質(zhì)，自然環(huán)境下可降解，在生態(tài)系統(tǒng)中不易積累，生態(tài)安全性較好[11]。魯志營等[12]研究化感抑藻的機理，發(fā)現(xiàn)化感物質(zhì)是通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)、影響藻細胞內(nèi)葉綠素合成從而破壞光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、影響藻細胞呼吸作用等進行抑藻?，F(xiàn)有的研究報道中從有抑藻作用的植物中分離鑒定出的化感物質(zhì)有沒食子酸、豆蔻酸、壬酸、N-苯基-1-萘胺、N-苯基-2-萘胺和鄰苯二酚等[13～17]。李霞發(fā)現(xiàn)大部分酚酸物質(zhì)都具有化感作用[18]，而且其自氧化產(chǎn)物對銅綠微囊藻抑制作用顯著，其中鄰苯二酚和沒食子酸是兩種常見的酚酸類化感物質(zhì)[19]。劉光濤等[20]發(fā)現(xiàn)常見的水生植物鳳眼蓮根系分泌物壬酸對銅綠微囊藻的抑制效果顯著。除水生植物以外，從陸生植物提取出的化感物質(zhì)也能破壞藻細胞的生長，倪利曉等[21]發(fā)現(xiàn)從黃花嵩莖葉中提取的青蒿素對銅綠微囊藻有良好的抑制效果，其作為抑藻劑的應用已經(jīng)申請專利。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青蒿素、壬酸、鄰苯二酚單獨作用于銅綠微囊藻時EC50為23.66mg/L、18.81mg/L、5.50mg/L。丁惠君等[19]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸對銅綠微囊藻的EC50為1.73mg/L。本研究以銅綠微囊藻為實驗藻種，在前期實驗的基礎上，進一步探討了青蒿素、壬酸、沒食子酸和鄰苯二酚四種化學物質(zhì)對銅綠微囊藻生長及葉綠素熒光的抑制效應的差異，以期為日后篩選和利用水生植物分泌的化感物質(zhì)來控制水華做出有益的探究。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

青蒿素(artemisinin，分析純)、壬酸(nonanoic acid，分析純)、沒食子酸(gallic acid，分析純)和鄰苯二酚(catechol，分析純)均購置于上海阿拉丁試劑有限公司。銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa，F(xiàn)ACHB-937)購自于中國科學院水生生物研究所。

2.2 實驗設計

2.2.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng)

采用BG-11無菌培養(yǎng)基對實驗所需銅綠微囊藻進行擴培，人工氣候箱溫度設置為(25±1)℃，光照強度設置為2 000 lx，光暗比 12 h∶12 h，每天搖動錐形瓶2～3次并適當調(diào)換位置。

2.2.2 實驗設置

將銅綠微囊藻擴大培養(yǎng)到對數(shù)期，在含有250mL藻液的錐形瓶中加入相同質(zhì)量濃度(12.4mg/L)的青蒿素、壬酸、沒食子酸和鄰苯二酚，并設置對照組，每組設置三個平行。測定第0d、1d、2d、3d、4d、7d的OD680值以及葉綠素熒光參數(shù)，并對結(jié)果進行處理和分析。

2.3 測定指標和方法

2.3.1 OD680和藻細胞計數(shù)

利用分光光度計測定銅綠微囊藻懸液在680nm處的OD值，根據(jù)提前繪制好的微囊藻生物量和吸光度之間的標準曲線(Y=8.796 3x+0.144 4, R2=0.998 5)計算細胞數(shù)[22]。

2.3.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定

利用浮游植物熒光儀( PHYTO-PAM，Germany)測定銅綠微囊藻懸液中葉綠素a含量和葉綠素熒光參數(shù)。相關(guān)參數(shù)含義如下：

Fv/Fm指PSⅡ的最大光化學量子產(chǎn)量，是對光系統(tǒng)Ⅱ光化學反應可能達到的最大產(chǎn)量的評估，是研究外界環(huán)境脅迫等因素對光合作用影響的重要指標[23]；

Alpha，初始斜率，反映了樣品對光能的利用效率[24]；

ETRmax，藻類最大光合速率，即最大相對電子傳遞速率[24]；

Ik，半飽和光照強度，反映了藻類對強光的耐受能力強弱[24]。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用WPS和origin9.0進行數(shù)據(jù)整理和作圖，測得的數(shù)據(jù)取均值。采用SPSS20.0對處理組和對照組的結(jié)果進行單因素方差分析，設P<0.05兩組之間存在顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長的影響

由圖1可知，同一抑制濃度(12.4mg/L)下，鄰苯二酚處理組對銅綠微囊藻的生長有顯著影響(P<0.05)，實驗第10d鄰苯二酚的抑制率為83.49%；青蒿素和壬酸處理組隨著實驗時間的延長也表現(xiàn)出了對銅綠微囊藻的抑制作用，培養(yǎng)第10d青蒿素和壬酸的抑制率分別為24.50%和18.80%；沒食子酸處理組實現(xiàn)初期表現(xiàn)出了對銅綠微囊藻的抑制作用，實驗第2d、第3d和第4d的抑制率分別為28.61%、28.34%和26.89%，實驗后期效果不明顯。酚酸類物質(zhì)容易氧化，自氧化產(chǎn)物對銅綠微囊藻抑制作用比較明顯[25]；有研究表明，沒食子酸在堿性、中性、強氧化條件下不穩(wěn)定[26]，沒食子酸后期表現(xiàn)不佳，沒有達到同類物質(zhì)鄰苯二酚的抑藻效果，很有可能是本實驗環(huán)境導致的；丁惠君等[19]則認為高濃度的沒食子酸使得藻液呈弱酸性( pH為6～7) ，不易發(fā)生自氧化反應，這也可能導致沒食子酸抑藻效果不如鄰苯二酚；具體原因還有待進一步研究。

圖1 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長影響Fig.1 Effects of four allelopathic substances on the growth of Microcystis aeruginosa

3.2 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

銅綠微囊藻細胞內(nèi)的葉綠素a主要位于光合系統(tǒng)Ⅱ的核心復合體上，能吸收能量傳遞到反應中心進行光化學反應[27]。當藻細胞受到環(huán)境脅迫時，其生理過程會受到影響，直接或間接地影響到葉綠素a含量，因此葉綠素 a 含量變化可以看成是藻類受到脅迫的生理反應指標[28]。由圖2可知，鄰苯二酚處理組對銅綠微囊藻的葉綠素a含量有顯著影響(P<0.05)，實驗第10d鄰苯二酚處理組葉綠素a含量僅為對照組的10.30%，這一結(jié)果與圖1所述的生長量抑制結(jié)果相符，銅綠微囊藻的生物量減少會直接造成葉綠素a含量下降；沒食子酸處理組在實驗初期葉綠素a含量顯著低于對照組(P<0.05)，實驗第1d、第2d和第3d的葉綠素a 含量分別占對照組的70.64%、68.91%和59.45%；青蒿素和壬酸處理組隨著時間的推移對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響逐漸增大，實驗第10d兩組的葉綠素a含量分別占對照組的75.99%和84.31%。

3.3 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻Fv/Fm的影響

Fv/ Fm是光合系統(tǒng)Ⅱ在暗適應后的最大量子產(chǎn)量[29]，代表植物和藻類潛在光合能力，數(shù)值變化能夠反映PSⅡ的受外界脅迫后的功能狀態(tài)變化。

圖2 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響Fig.2 Effects of four allelopathic substances on chlorophyll a content in Microcystis aeruginosa

由圖3可知，除鄰苯二酚處理組外，其他4組包括對照組的Fv/Fm值維持在0.25～0.40之間；實驗第一天時，除青蒿素處理組外，其他3個處理組較對照組而言，F(xiàn)v/Fm值都下降了，其中壬酸組下降了12.18%，沒食子酸組下降了17.00%，鄰苯二酚處理組下降了95.18%，這說明壬酸、沒食子酸、鄰苯二酚抑制了銅綠微囊藻的光合活性，削弱了藻類的潛在光合能力；其中鄰苯二酚處理組Fv/Fm值已經(jīng)接近0，實驗后期也維持了顯著的抑制效果，這說明鄰苯二酚從根本上破壞了銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)，因此脅迫效應顯著；沒食子酸處理組、青蒿素處理組和壬酸處理組后期數(shù)值高于對照組，則說明沒食子酸、青蒿素和壬酸只是短期內(nèi)抑制了銅綠微囊藻PSⅡ的光合活性，后期藻細胞光合功能得以恢復甚至增強。

圖3 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻Fv/Fm的影響Fig.3 Effects of four allelopathic substances on Fv/Fm of Microcystis aeruginosa

3.4 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻α的影響

圖4 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻α的影響Fig.4 Effects of four allelopathic compounds on α of Microcystella aeruginosa

由圖4可知，除鄰苯二酚處理組外，其他四組包括對照組的銅綠微囊藻α值維持在0.11～0.18之間；實驗第一天時，除壬酸處理組外，其他3個處理組和對照組α值都下降了；隨著時間的推移，壬酸處理組的α值在第三天開始下降；鄰苯二酚處理組α值在實驗第一天的時候已經(jīng)接近0，實驗后期也維持了顯著的抑制效果，進一步說明鄰苯二酚從根本上破壞了銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)；對照組的α值呈現(xiàn)下降趨勢，很有可能是銅綠微囊藻大量生長，導致對光和其他營養(yǎng)物質(zhì)的競爭加劇，因此削弱了藻細胞對光能的利用效率；而其他四個處理組，除了從根本上破壞了藻細胞PSⅡ的鄰苯二酚處理組，實驗第10d時，青蒿素組、壬酸組和沒食子酸組的α值分別高于對照組24.07%、30.56%和71.29%。

3.5 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻ETRmax的影響

ETRmax反映了藻類的潛在最大光合速率，是光合活性的重要指標，可以指示藻類的“生長潛能”[30]。由圖5可知，除沒食子酸處理組外，其他四組的電子傳遞速率總體都呈現(xiàn)下降的趨勢；鄰苯二酚處理組ETRmax值在實驗第一天的時候已經(jīng)接近0，實驗后期也維持了顯著的抑制效果；青蒿素處理組的ETRmax值隨著時間的推移越來越小，實驗第10d時接近為0；這說明鄰苯二酚和青蒿素對銅綠微囊藻的光合活性抑制作用是持續(xù)的，藻細胞的光合系統(tǒng)Ⅱ可能遭受到了不可恢復的破壞；壬酸處理組的ETRmax值與對照組的相近，實驗第10d時略低于對照組；沒食子酸處理組ETRmax值表現(xiàn)出了先增加后減小的趨勢，但是始終高于其他三個處理組和對照組，實驗第10d時顯著高于對照組，Ihnken 等[31]發(fā)現(xiàn)藻細胞的非光化學猝滅( NPQ) 活性能影響光合作用電子傳遞速率，沒食子酸處理組的銅綠微囊藻細胞ETRmax顯著高于其他四組，這可能與藻細胞的NPQ有關(guān)。

圖5 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻ETRmax的影響Fig.5 Effects of four allelopathic substances on ETRmax of Microcystis aeruginosa

3.6 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻Ik的影響

Ik值可以反映藻類對強光的耐受能力。由圖6可知，鄰苯二酚處理組Ik值在實驗第一天的時候已經(jīng)接近0，實驗后期也維持了顯著的抑制效果；青蒿素處理組的Ik值隨著時間的推移越來越小，實驗第10d時接近為0，與該處理組的ETRmax值變化規(guī)律相似，這進一步說明青蒿素對銅綠微囊藻的光合活性抑制作用是持續(xù)的；壬酸處理組的Ik值與對照組的相近，實驗第10d時略低于對照組，這也和該處理組的ETRmax值變化規(guī)律相似，說明藻類潛在光合速率減小伴隨而來的是對強光的耐受能力減弱；沒食子酸處理組Ik值表現(xiàn)出了先增加后減小的趨勢，但是始終高于其他3個處理組和對照組，實驗第10d時高于對照組41.73%，這說明沒食子酸增強了銅綠微囊藻對強光的耐受能力。

圖6 4種化感物質(zhì)對銅綠微囊藻Ik的影響Fig.6 Effects of four allelopathic substances on Ik of microcystis aeruginosa

4 結(jié) 論

4.1 在本文試驗條件下，4種化感物質(zhì)中鄰苯二酚對銅綠微囊藻的抑制效果最好，青蒿素次之。

4.2 鄰苯二酚、青蒿素和壬酸都通過降低銅綠微囊藻的葉綠素 a 含量、光合速率、對強光的耐受能力而抑制其生長。

4.3 鄰苯二酚和青蒿素對銅綠微囊藻PSⅡ的光合活性破壞是持續(xù)的，不可恢復的。